Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo
Summary
Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.
Abstract
Imagens de células ao vivo dinâmica permite a visualização direta de tempo-real interações entre as células do sistema imunitário 1, 2, no entanto, a falta de controle espacial e temporal entre a célula fagocítica e micróbio tornou foco observações sobre a interação inicial de resposta do hospedeiro a patógenos difícil. Historicamente, os eventos de contato intercelular tais como fagocitose 3 foram fotografadas pela mistura de dois tipos de células, e depois continuamente digitalização do campo de visão para encontrar serendipitous contatos intercelulares no estágio apropriado de interação. A natureza estocástica desses eventos torna este processo tedioso, e é difícil de observar eventos cedo ou fugazes em contato célula-célula por esta abordagem. Este método requer encontrar pares de células que estão à beira de contato, e observá-los até que entre em contato com consumado, ou não. Para lidar com essas limitações, nós usamos a captura óptica como um método não invasivo, não-destrutivo, mas rápido e eficaz para a posição células em cultura.
Armadilhas ópticas, ou pinças ópticas, estão cada vez mais utilizados em pesquisa biológica para capturar e manipular fisicamente as células e outros micro-empresas partículas em três dimensões 4. Pressão de radiação foi observada pela primeira vez e aplicada a sistemas de pinça óptica em 1970 5, 6, e foi usado pela primeira vez para controlar espécimes biológicos em 1987 7. Desde então, a pinça óptica amadureceram em uma tecnologia para sondar uma variedade de fenômenos biológicos 13/08.
Nós descrevemos um método de 14 que avanços ao vivo imagens de células através da integração de uma armadilha óptica com spinning microscopia confocal de disco com controle de temperatura e umidade para fornecer controle espacial e temporal requintada de organismos patogênicos em um ambiente fisiológico para facilitar a interação com células hospedeiras, como determinado pelo operador. Live, organismos patogênicos, como Candida albicans e Aspergillus fumigatus, que pode causar potencialmente letal, infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos 15, 16 (por exemplo, AIDS, quimioterapia e transplante de órgãos doentes), foram presos opticamente usando intensidades não-destrutivo a laser e mudou-se junto ao macrófagos, o que pode fagocitam o patógeno. De alta resolução, transmitido filmes de luz e de fluorescência baseada estabelecida a capacidade de observar os primeiros eventos de fagocitose em células vivas. Para demonstrar a ampla aplicabilidade em imunologia, principais células T também foram presos e manipulados para formar sinapses com anti-CD3 microesferas revestidas in vivo, e lapso de tempo de imagem de formação de sinapses também foi obtida. Ao fornecer um método para exercer o controle de patógenos espaciais bem viver com respeito às células imunológicas, as interações celulares podem ser capturados por microscopia de fluorescência com perturbação mínima para as células e pode render uma visão poderosa em respostas iniciais de imunidade inata e adaptativa.
Protocol
Discussion
Neste trabalho nós usamos uma armadilha óptica para capturar patógenos com dimensões entre 3 mm – 5 mm. Apesar de patógenos de interesse para o nosso laboratório normalmente têm estas dimensões, o sistema de pinça óptica aqui descrito é flexível para capturar uma grande variedade de tamanhos. Na verdade armadilhas ópticas têm sido usados para capturar partículas que variam de átomos individuais para as células de aproximadamente 10 m de diâmetro. Além disso, este sistema de captura óptica foi c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Massachusetts General Hospital Departamento de Fundos de Medicina Interna (JMT, MKM, MLC, JMV), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia conceder T32EB006348 (CEC), Centro de Massachusetts General Hospital para financiar Computacional e Integrative Biology desenvolvimento e AI062773 ( rjh), concede AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI057999 (JMV ). Agradecemos a Nicholas C. Yoder para discussões úteis, e Charles Felts (RPI, Inc.) para obter assistência técnica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
Referências
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