Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie
Summary
Ein<em> In vivo</em> Bildgebungsprotokoll zu primären sensorischen Axone folgenden Spinalganglien crush-Monitor beschrieben. Die Verfahren nutzen wide-field Fluoreszenzmikroskopie und THY1-YFP transgenen Mäusen, und erlauben wiederholte Bildgebung Axonregeneration über 4 cm im PNS und Axon Wechselwirkungen mit der Oberfläche des ZNS.
Abstract
Die primären sensorischen Axone durch spinale Verletzungen verletzt ausfallen, um in das Rückenmark zu regenerieren, was zu chronischen Schmerzen und dauerhaften Verlust der Empfindung. Regeneration der Spinalganglien (DR) Axone in das Rückenmark an der Spinalganglien Eingangszone (Drez), die Schnittstelle zwischen dem ZNS und PNS verhindert. Unser Verständnis der molekularen und zellulären Vorgänge Regeneration bei Drez zu verhindern, ist unvollständig, zum Teil, weil komplexe Änderungen mit Nervenverletzung verbunden von postmortalen Analysen abgeleitet worden sind. Dynamische zelluläre Prozesse, wie Axonregeneration, werden am besten mit Techniken, die Echtzeit-Ereignisse mit mehreren Beobachtungen von jedem lebenden Tier einzufangen untersucht. Unsere Fähigkeit, Neuronen seriell in vivo-Monitor hat dramatisch zugenommen aufgrund revolutionäre Innovationen in der Optik-und Maus-Transgenen. Mehrere Linien der THY1-GFP transgenen Mäusen, bei denen Teilmengen von Neuronen genetisch in unterschiedlichen fluoreszierenden Farben markiert, ermöglichen individuelle Neuronen in vivo 1 abgebildet werden. Diese Mäuse wurden umfassend in-vivo-Bildgebung von Muskel 2-4 und 5-7 Gehirn verwendet, und sofern neue Einblicke in physiologische Mechanismen, die statischen Analysen nicht gelöst haben könnte. Imaging-Studien von Neuronen im Rückenmark leben erst seit kurzem. Lichtman und seine Kollegen demonstrierten ihre Realisierbarkeit durch die Verfolgung verletzt dorsalen Spalte (DC) Axone mit Weitfeldmikroskopie 8,9. Multi-Photonen-in-vivo-Bildgebung von tief positioniert DC Axone hat Mikroglia und Blutgefäße, auch schon 10 erreicht. In den letzten Jahren haben wir bei der Anwendung in-vivo-Bildgebung, um die Regeneration von Axonen DR mit Weitwinkel-Mikroskopie und H-Linie von THY1-YFP Mäusen Monitor Pionierarbeit. Diese Studien haben wir eine neuartige Hypothese darüber, warum DR Axone sind aus nachwachsenden innerhalb des Rückenmarks 11 verhindert geführt.
In H-Linie von THY1-YFP Mäusen unterscheiden YFP + Axone oberflächlich positioniert, die ermöglicht, dass mehrere Axone gleichzeitig überwacht werden. Wir haben gelernt, dass DR Axone Ankunft am Drez besser in Lendenwirbelsäule als im zervikalen Rückenmarks abgebildet. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir verschiedene Strategien, die wir als nützlich erwiesen, um langfristig erfolgreich und wiederholte Bildgebung zu regenerieren DR Axone zu gewährleisten haben. Dazu gehören Methoden, die wiederholt Intubation und Atemwege Unterbrechung zu beseitigen, zu minimieren Chirurgie-assoziierten Stress und Narbenbildung, und erwerben stabile Bilder mit hoher Auflösung ohne Phototoxizität.
Protocol
Discussion
Imaging DR Regeneration direkt in lebenden Mäusen ist eine besondere Herausforderung, weil es eine erhebliche dorsale Laminektomie benötigt, um Axon-Wachstum über einen weiten Bereich von mehreren invasive chirurgische und Anästhesieverfahren in aufeinander folgenden Sitzungen folgten überwachen. Mehrere Strategien dazu beigetragen, diese Herausforderungen zu meistern. Erste erfolgreiche Bildgebung erforderlich Reduzierung Maus Mortalität (ca. 25%) durch die Minimierung der Dauer der Narkose und Blutungen, und dur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Dr. Alan Tessler für Kommentare und Leitartikel zu helfen. Diese Arbeit wurde vom NIH NS062320 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Referências
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
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- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
