Summary

イメージングG -タンパク質共役受容体(GPCR)を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Published: September 20, 2011
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Summary

ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。

Abstract

多くの真核細胞は、その環境での化学信号の勾配を検出し、それに応じて1を移行することができます。このガイド付きの細胞遊走は、免疫細胞や神経細胞2、3のパターニングの人身売買など、その機能を遂行するために様々な細胞に不可欠な走化性、と呼ばれます。 G -タンパク質共役受容体(GPCR)の大家族は、in vivoで 4 細胞移動を指示するために、ケモカインとして知られている変数の小さなペプチドを、検出する。走化性研究の最終目標は、GPCRの機械感覚のケモカインの勾配とコントロールが走化性につながるイベントを通知する方法を理解することです。この目的のために、我々は、リアルタイムで、化学誘引物質の勾配に誘引物質、細胞運動の時空間濃度を監視するためのイメージング技術を使って、GPCRは三量体G -タンパク質の活性化を仲介し、5月8日真核細胞の走化性に関与する細胞内シグナル伝達イベント。単純な真核生物、 キイロタマホコリカビは 、白血球のに似ているchemotaxic動作を表示し、D.カビは真核生物化学走性を研究するための重要なモデル系である。自由生活アメーバ、D.などdiscoideumの細胞豊富な培地で割ります。飢餓時には、細胞は、multicullular構造を形成するためにcAMPを介した走化性を介して集約した発生プログラムを入力してください。 cAMPに走化性に関与する多くのコンポーネントは、Dで確認されているカビ 。 GPCR(CAR1)へのcAMPの結合はGγとGβγサブユニット7、9、10にヘテロ三量体G -タンパク質の解離を誘導する。 Gβγサブユニットは、順番に細胞膜11-13 PIP 3にPIP 2を変換し、PI3Kを活性化Rasを活性化する。 PIP 3はこのよう14、15にこれらのタンパク質を募集し、プレクストリン相同(PH)ドメインを持つタンパク質の結合部位として機能する。 CAR1受容体の活性化はまた、PIP 2 16、17にPIP 3を脱リン酸化PTEN、の膜の関連付けを制御します。分子メカニズムは、進化的にそのような好中球18のようなヒト細胞のケモカインGPCRを介した走化性で保存されている。我々は、D.の走化性を研究するための次の方法を提示discoideumの細胞 。 1。走化性成分の細胞の調製。 2。 cAMPの勾配における細胞のイメージングは​​、走化性。 3。単一の生細胞におけるGタンパク質ヘテロのGPCR誘導活性を監視する。 4。リアルタイムで単一の生細胞のイメージングは、化学誘引物質トリガダイナミックPIP 3の応答。私たちの開発した撮像法は、ヒト白血球の走化性を研究するために適用することができます。

Protocol

1。 キイロタマホコリカビの走コンピテントセルの調製化学誘引物質cAMPに走ているD. discoideumの細胞、22で振とう培養からD3 – Tリッチメディアに成長して収穫の細胞を生成するには℃、 (DBバッファは5mMのNa 2 HPO 4、5mMのKH 2 PO 4、2mMのMgCl 2、及び0.1mMのCaCl 2を含む)非栄養発達バッファーで細胞を2回洗浄する。 2 × 10…

Discussion

細胞の走化性有能な段階に到達するプロセス

野生型のためのD. discoideumの細胞 、それは細胞がうまく偏光細胞形態と迅速な細胞の遊走(図1)が表示される間も、走化性有能な段階にそれらを誘導するために、室温で開発をパルス〜5約6時間かかります。このようなcAMPのパルスの濃度、温度、および異なる遺伝的背景など、いくつかの要因は、走化性有能なステージに…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIAID、NIHから学内資金でサポートされています。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
D3-T Growth Media KD Medical    
Caffeine Sigma    
Latrunculin B Molecular Probes    
Alexa 594 Molecular Probes    
cAMP Sigma    
ChronTrol XT programmable timer ChronTrol Corp    
Miniplus 3 peristaltic pump Gilbson    
Platform rotary shaker      
FemtoJet microcapillary pressure supply Eppendorf    
Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International    
LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope Zeiss   a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
Olympus X81 or equivalent Olympus   Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens

Referências

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Citar este artigo
Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128, doi:10.3791/3128 (2011).

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