Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em
Summary
A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células eucariotas.
Abstract
Muchas células eucariotas pueden detectar gradientes de señales químicas en sus entornos y en consecuencia la migración 1. Esta migración de las células guiadas se conoce como quimiotaxis, que es esencial para varias células para llevar a cabo sus funciones, como el tráfico de las células inmunes y los patrones de las células neuronales 2, 3. Una gran familia de receptores de la proteína G-acoplada (GPCR) detecta variable de péptidos pequeños, conocidos como quimiocinas, para dirigir la migración celular in vivo 4. El objetivo final de la quimiotaxis de investigación es entender cómo un GPCR sentidos maquinaria gradientes de quimioquinas y los controles de los eventos de señalización que conducen a la quimiotaxis. Para ello, utilizamos técnicas de imagen para controlar, en tiempo real, las concentraciones de espacio-temporal del movimiento quimiotácticos de células, en un gradiente de quimioatrayente, mediada por la activación de GPCR heterotrimeric G-proteína, y los eventos intracelulares de señalización implicadas en la quimiotaxis de las células eucariotas 5.8 . El organismo simple eucariotas, Dictyostelium discoideum, muestra comportamientos quimiotaxis que son similares a los de los leucocitos, y D. discoideum es un modelo de sistema clave para el estudio de la quimiotaxis de eucariotas. Como amebas de vida libre, D. las células se dividen discoideum en medio rico. Sobre el hambre, las células entran en un programa de desarrollo en el que agregada a través de AMPc mediada la quimiotaxis para formar estructuras multicullular. Muchos de los componentes involucrados en la quimiotaxis de los campamentos han sido identificados en el D. discoideum. La unión del AMPc a un GPCR (CAR1) induce la disociación de heterotrimeric proteínas G en Gγ y 7 subunidades Gβγ, 9, 10. Subunidades Gβγ activar Ras, que a su vez activa la PI3K, convirtiendo PIP PIP 2 pt 3 en la membrana celular 11-13. PIP 3 sirven como sitios de unión para las proteínas con homología pleckstrin (PH) dominios, con lo que reclutar a estas proteínas de la membrana 14, 15. La activación de receptores CAR1 también controla las asociaciones de la membrana de PTEN, que desfosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. Los mecanismos moleculares que son conservadas evolutivamente en las quimiocinas GPCR mediada por quimiotaxis de las células humanas, como los neutrófilos 18. Se presentan los siguientes métodos para el estudio de la quimiotaxis de D. células discoideum. 1. Preparación de las células componentes quimiotácticos. 2. Imágenes de la quimiotaxis de las células en un gradiente de cAMP. 3. Vigilancia de la activación inducida por GPCR de heterotrimeric G-proteína en las células individuales en vivo. 4. Imágenes quimioatrayente activada por PIP dinámica 3 respuestas en una sola las células vivas en tiempo real. Nuestra desarrollado métodos de imagen se pueden aplicar para estudiar la quimiotaxis de los leucocitos humanos.
Protocol
Discussion
El proceso de llegar a la etapa quimiotáctica de las células competentes
De tipo salvaje D. células discoideum, se tarda unos 5 a 6 horas pulsando el desarrollo a temperatura ambiente para inducir a un estado competente bien quimiotácticas durante el cual las células presentan una morfología celular y la migración celular polarizada y rápida (Fig. 1). Varios factores, tales como los campos de concentración de pulso, temperatura, y diferentes fondos genéticos, pueden …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el fondo de intramuros del NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
Referências
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
