Este artigo descreve a rotulagem de superfície e Ex ovo Cultura de tecidos no embrião de galinha cedo. Técnicas passíveis de lapso de tempo de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica de imagem são apresentados. Etiquetas de rastreamento de superfície com resolução espaço-temporal permite alta quantidades cinemáticas, como cepas morfogenética (deformações), a ser calculado de duas e três dimensões.
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Artigo de método
Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embrionárias epitélios sofrem deformações complexos (por exemplo, dobrar, torcer, dobrar, e alongamento) para formar os órgãos primitivo do embrião em estágio inicial. Rastreamento de marcadores fiduciais na superfície dessas folhas celular é um método bem estabelecido para estimar quantidades morfogenéticos, tais como crescimento, cisalhamento contração, e. No entanto, nem todas as técnicas de rotulagem de superfície são facilmente adaptáveis às modalidades de imagem convencional e possui diferentes vantagens e limitações. Aqui, descrevemos dois métodos de rotulagem e ilustrar a utilidade de cada técnica. No primeiro método, centenas de etiquetas fluorescentes são aplicadas simultaneamente para o embrião usando partículas de ferro magnético. Esses rótulos são então usadas para quantidade deformações 2-D durante a morfogênese do tecido. No segundo método, poliestireno microesferas são usadas como agentes de contraste em não-invasivo tomografia de coerência óptica de imagem (OCT) para acompanhar as deformações do tecido 3-D. Estas técnicas têm sido bem sucedidasly implementados em nosso laboratório para estudo The mecanismos físicos de dobra a cabeça no início, o coração, eo desenvolvimento do cérebro, e deve ser adaptável a uma ampla gama de processos morfogenéticos.
Protocolo
1. Preparação Geral Experimental
- Prepare o meio de cultura de tecidos na capela de fluxo laminar.
- Dilua Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) (1 garrafa de 4,5 g L com / L de glicose, bicarbonato de sódio, e L-glutamina). Adicionar 10 mL de penicilina / estreptomicina / neomicina antibióticos.
- Remova 100 mL de DMEM com uma pipeta de transferência estéril e substituir por 100 ml de soro pinto.
- Alíquota a garota DMEM/10% de soro / antibióticos de 1% em 15 mL estéreis frascos cônicos e congelar.
- Prepare tampão fosfato salino (PBS), suplementado com cálcio e magnésio. Misturar 100 mL PBS 10X, 900 mL de água deio....
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Discussão
Duas técnicas de rotulagem de tecido são apresentados para a cultura ex ovo de embriões de galinha cedo. O primeiro usa corantes fluorescentes lipofílico entregues via partículas de ferro magnético para simultaneamente rótulo centenas de células. No entanto, este método não é compatível com tomografia de coerência óptica, como corantes fluorescentes mostram geralmente pouco contraste dos tecidos adjacentes utilizando 10 de outubro. Por isso, vamos mostrar uma técnica alternativa utilizando o poliesti.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 e R01 GM075200 HL083393 (LAT). Reconhecemos o apoio de bolsas para BAF do NIH T90 DA022871 e do Instituto de Radiologia Mallinckrodt, e para VDV da concessão 09PRE2060795 da Associação Americana do Coração.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material / Reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| DMEM - glicose alta | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicilina / estreptomicina / Neomicina | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Phosphate Buffered Saline Dulbecco | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman # 2 Papel Filtro | Whatman | 1002 090 | 90 milímetros de diâmetro |
| Micropipetas de vidro | Precision mundoInstrumentos (WPI) | TW150-6 | Diâmetro interno 1,5 milímetros |
| DII | Invitrogen | D-282 | |
| Redução de ferro | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 M Diâmetro Microesferas (preto) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (para a cultura do lapso de tempo) | Bioptechs | 04200415B | 0,17 milímetros de espessura, preto |
| Delta Controlador Dish T4 Cultura | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Bomba Dispositivo de Fluxo Variável | Fisher Scientific |
Referências
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
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Reimpressões e permissões
