Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce
Summary
Este artigo descreve a rotulagem de superfície e<em> Ex ovo</em> Cultura de tecidos no embrião de galinha cedo. Técnicas passíveis de lapso de tempo de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica de imagem são apresentados. Etiquetas de rastreamento de superfície com resolução espaço-temporal permite alta quantidades cinemáticas, como cepas morfogenética (deformações), a ser calculado de duas e três dimensões.
Abstract
Embrionárias epitélios sofrem deformações complexos (por exemplo, dobrar, torcer, dobrar, e alongamento) para formar os órgãos primitivo do embrião em estágio inicial. Rastreamento de marcadores fiduciais na superfície dessas folhas celular é um método bem estabelecido para estimar quantidades morfogenéticos, tais como crescimento, cisalhamento contração, e. No entanto, nem todas as técnicas de rotulagem de superfície são facilmente adaptáveis às modalidades de imagem convencional e possui diferentes vantagens e limitações. Aqui, descrevemos dois métodos de rotulagem e ilustrar a utilidade de cada técnica. No primeiro método, centenas de etiquetas fluorescentes são aplicadas simultaneamente para o embrião usando partículas de ferro magnético. Esses rótulos são então usadas para quantidade deformações 2-D durante a morfogênese do tecido. No segundo método, poliestireno microesferas são usadas como agentes de contraste em não-invasivo tomografia de coerência óptica de imagem (OCT) para acompanhar as deformações do tecido 3-D. Estas técnicas têm sido bem sucedidasly implementados em nosso laboratório para estudo The mecanismos físicos de dobra a cabeça no início, o coração, eo desenvolvimento do cérebro, e deve ser adaptável a uma ampla gama de processos morfogenéticos.
Protocol
Discussion
Duas técnicas de rotulagem de tecido são apresentados para a cultura ex ovo de embriões de galinha cedo. O primeiro usa corantes fluorescentes lipofílico entregues via partículas de ferro magnético para simultaneamente rótulo centenas de células. No entanto, este método não é compatível com tomografia de coerência óptica, como corantes fluorescentes mostram geralmente pouco contraste dos tecidos adjacentes utilizando 10 de outubro. Por isso, vamos mostrar uma técnica alternativa utiliz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 e R01 GM075200 HL083393 (LAT). Reconhecemos o apoio de bolsas para BAF do NIH T90 DA022871 e do Instituto de Radiologia Mallinckrodt, e para VDV da concessão 09PRE2060795 da Associação Americana do Coração.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
Referências
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