Spårning Deformationer Morphogenetic Tissue i tidig Chick Embryo
Summary
Denna artikel beskriver yta märkning och<em> Ex ovo</em> Vävnadskultur i början kycklingembryo. Tekniker mottaglig för time-lapse ljusa fält, fluorescens och optisk koherens tomografi avbildning presenteras. Spårning yta etiketter med hög Spatiotemporal upplösning gör kinematiska storheter som morfogenetiska stammar (deformationer) skall beräknas i både två och tre dimensioner.
Abstract
Embryonala epitel genomgå komplex deformationer (t.ex. böjning, vridning, vikning, och stretching) för att bilda den primitiva organ tidiga embryot. Spårning referenspunkternas markörer på ytan av dessa cellulära ark är en väletablerad metod för att uppskatta morfogenetiska storheter som tillväxt, kontraktion, och skjuvning. Men inte alla ytor märkning tekniker är lätt att anpassa till konventionell avbildning och har andra fördelar och begränsningar. Här beskriver vi två märkning metoder och illustrera nyttan av varje teknik. I den första metoden, finns hundratals fluorescerande etiketter tillämpas samtidigt på embryot med hjälp av magnetiska järn partiklar. Dessa etiketter används sedan för att kvantiteten 2-D vävnad deformationer under morfogenes. I den andra metoden, är frigolit mikrosfärer som används som kontrastmedel i icke-invasiv optisk koherens tomografi (OCT) imaging att spåra 3-D vävnad deformationer. Dessa tekniker har varit framgångsrikaly genomförts i vårt labb för att studythe fysiska mekanismer för tidig huvud gånger, hjärtat och hjärnans utveckling, och bör anpassas till en mängd processer utbud morfogenetiska.
Protocol
Discussion
Två vävnad märkning tekniker presenteras för ex ovo kultur tidiga kycklingembryon. Den första använder fluorescerande lipofila färger levereras via magnetiska järnpartiklar att samtidigt etikett hundratals celler. Men denna metod som för närvarande inte kompatibla med optisk koherens tomografi, som fluorescerande färger i allmänhet visar lite kontrast från omgivande vävnader med 10 oktober. Därför visar vi en alternativ teknik med hjälp av polystyren mikrosfärer att märka vävnader…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av NIH bidrag R01 GM075200 och R01 HL083393 (LAT). Vi erkänner gemenskap stöd för BAF från NIH T90 DA022871 och Mallinckrodt Institutet för radiologi, och för VDV från Grant 09PRE2060795 från American Heart Association.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
Referências
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
