Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi
Summary
Bu makale, yüzey etiketleme ve tanımlar<em> Ex ovo</em> Erken civciv embriyo doku kültürü. Time-lapse parlak alan, floresan, ve optik koherens tomografi görüntüleme için uygun teknikler sunulmaktadır. Yüksek uzaysal çözünürlüğü ile Takip yüzey etiketler, iki ve üç boyutlu hem de hesaplanabilir morfogenetik suşlar (deformasyonlar) gibi kinematik miktarlarda sağlar.
Abstract
Embriyonik epitel erken embriyo ilkel organları oluşturmak için karmaşık deformasyonlar (örneğin, bükme, kıvırma, katlama, ve germe) tabi tutulurlar. Bu hücresel yaprak yüzeylerde fiducial belirteçleri Takip büyüme, daralma ve kayma gibi morfogenetik miktarlarda tahmin etmek için köklü bir yöntemdir. Ancak, tüm yüzey etiketleme teknikleri, geleneksel görüntüleme yöntemleri kolayca adapte ve farklı avantajları ve sınırlamaları sahip. Burada, iki etiketleme yöntemleri anlatılmakta ve her iki tekniğin yararını göstermektedir. İlk yöntem, yüzlerce floresan etiket, manyetik demir parçacıkları kullanarak embriyonun aynı anda uygulanır. Bu etiketler, daha sonra 2-B doku deformasyonları miktarına morfolojilerinden sırasında kullanılır. İkinci yöntem, polistiren mikroküreler 3-D doku deformasyonları izlemek için non-invaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kontrast ajanlar olarak kullanılmaktadır. Bu teknikler başarılı olmuşturly erken baş kat, kalp ve beyin gelişimi fiziksel mekanizmalar studythe bizim laboratuvarda uygulanan ve geniş bir yelpazede morfogenetik süreçlerine uyarlanabilir olmalıdır.
Protocol
Discussion
İki doku etiketleme teknikleri, erken civciv embriyo ex ovo kültürü için sunulmuştur . Ilk hücre aynı anda yüzlerce etiket, manyetik demir parçacıkları ile teslim floresan lipofilik boyalar kullanır. Ancak, bu yöntem, floresan boyalar genellikle 10 Eki kullanarak çevre dokulara çok az kontrast gösterdiği gibi, şu anda optik koherens tomografi ile uyumlu değildir . Bu nedenle, biz time-lapse OCT analizi için doku etiket polystyrene küreler kullanarak alternatif bir yöntemdir. Bu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe, R01 GM075200 ve R01 HL083393 (LAT) tarafından desteklenmiştir. Biz BAF için burs desteği kabul NIH T90 DA022871 ve Mallinckrodt Radyoloji Enstitüsü ve Amerikan Kalp Birliği hibe 09PRE2060795 VDV için.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
Referências
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
