Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.
Nach Freisetzung von Neurotransmittern im zentralen Nerven-Terminals sind SVs schnell durch Endozytose abgerufen. Retrieved SVs werden dann mit Neurotransmitter befüllt und wieder in den Recycling-Pool, als SVs definiert, die für Exozytose 1,2 sind. Die leicht lösbare pool (RRP) und die Reserve-Pool (RP) – Die Recycling-Pool kann in der Regel in zwei verschiedene Pools aufgeteilt werden. Wie die Namen vermuten lassen, besteht die UVP des SVS, die sofort verfügbar sind für die Fusion, während RP SVs nur während intensiver Stimulation 1,2 freigesetzt werden. Es ist wichtig, einen zuverlässigen Test, dass die unterschiedliche Auffüllung dieser SV-Pools Berichte, um 1 zu verstehen) haben, wie SVs Verkehr nach verschiedenen Modi der Endozytose (wie Clathrin-abhängige Endozytose und Aktivitäts-abhängigen bulk Endozytose) und 2) die Mechanismen Steuerung der Mobilisierung sowohl der UVP und RP in Reaktion auf verschiedene Reize.
FM Farbstoffe werden routinemäßig eingesetzted quantitativ Bericht SV Umsatz in Zentral-Nerven-Terminals 3-8. Sie haben einen hydrophoben Kohlenwasserstoff-Schwanz, der reversible Partitionierung ermöglicht in der Lipid-Doppelschicht und einer hydrophilen Kopfgruppe, die Blöcke Passage durch Membranen. Die Farbstoffe haben wenig Fluoreszenz in wässriger Lösung, aber ihre Quantenausbeute steigt dramatisch, wenn in Membran 9 unterteilt. So FM Farbstoffe sind ideal fluoreszierenden Sonden für das Tracking aktiv Recycling SVs. Die Standard-Protokoll für den Einsatz von FM-Farbstoff ist wie folgt. Zuerst werden sie zu Neuronen angewendet und sind während der Endozytose aufgenommen (Abbildung 1). Nach nicht verinnerlicht Farbstoff wird von der Plasmamembran, Recycling SVs Umverteilung innerhalb der Recycling-Pool gewaschen. Diese SVs sind dann erschöpft mit Entladen Reize (Abbildung 1). Da FM Farbstoff Kennzeichnung von SVS ist quantal 10, ist die resultierende Fluoreszenz Tropfen proportional zu der Menge von Vesikeln freigesetzt. So erwirtschaftete das Recycling und die Fusion von SV aus dem previous Runde der Endozytose verlässlich quantifiziert werden.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, das modifiziert wurde, um zwei zusätzliche Elemente von Informationen zu erhalten. Erstens sind sequentielle Entladen Reize verwendet, um differentiell Entladen der UVP und der RP, um die Quantifizierung der Auffüllung der spezifischen SV-Pools ermöglichen. Zweitens wird jede Nervenendigung das Protokoll zweimal. So kann die Reaktion der gleichen Nerv Terminal S1 gegen die Anwesenheit einer Testsubstanz in der Phase S2 (Abbildung 2) verglichen werden, die Bereitstellung eines internen Kontrollsystems. Dies ist wichtig, da das Ausmaß der SV-Recycling über verschiedene Nervenendigungen ist sehr variabel 11.
Jeder Anhänger primären neuronalen Kulturen für dieses Protokoll verwendet werden kann, jedoch die Beschichtungs-Dichte, Lösungen und Stimulation Bedingungen sind für zerebelläre Nervenzellen Granulat (CGNs) 12,13 optimiert.
FM Farbstoffe werden in großem Umfang verwendet werden, um Nervenendigung Funktion in vielen neuronalen Vorbereitungen zu untersuchen. Sie wurden vor allem auf das Ausmaß der entweder SV Endozytose, SV Umsatz oder die Kinetik der Exozytose 6 zu überwachen beschäftigt. Das beschriebene Protokoll erweitert diese Studien, um die Differenz Entladen von bestimmten SV-Pools zu untersuchen. Dies bietet zusätzliche Informationen über die Wiederauffüllung der SV-Pools und auch ihr Ausmaß der Mobilisierung.
FM-Farbstoffe können mehrere Runden SV Recycling innerhalb der gleichen Nervenenden Label sein. Wir haben diese Eigenschaft genutzt und gestaltet Protokolle, in denen SV Umsatz in jedem Terminal zweimal in den gleichen Nervenenden überwacht werden kann. Dies ermöglicht eine genaue interne Kontrolle, die wesentlich aufgrund der heterogenen Natur der SV-Recycling in parallel Nervenendigungen 11 ist. Über die Verwendung der S1-Phase als interne Kontrolle, das Nachfüllen der RRP, RP und die gesamteSV-Pool in der Gegenwart von Arzneimitteln zuverlässig und direkt verglichen werden.
Neben der Bereitstellung von Informationen über die absolute Größe des Recycling, RRP und RP-Pools unter verschiedenen Stimulation Bedingungen kann dieses Protokoll auch Daten für die folgenden – 1) Die Aufteilung der SVS zwischen dem Marktpreis und RP in Abhängigkeit von der Recycling-Pool für S1 und S2, 2) die relative Größe der S2-Pools (RRP und RP) als Funktion der gesamten S1 Recycling-Pool und 3) die relative Größe einer definierten SV Pool in S2 in Abhängigkeit von den gleichen Pool in S1. Dieses Protokoll wird insbesondere keine Informationen über Entladen Kinetik jedoch seit der Übernahme der Zeit ist zu langsam (für kinetische Messungen Messzeiten sollten so zügig wie möglich und Entladen automatisch synchronisiert image capture).
Unsere 30 Hz 2 s Stimuli evoziert ein identisches Ausmaß der RRP Entladen zu hypertonen Saccharose 8. Da die Größe des RRPvon hypertoner Saccharose Entladen 15 definiert ist, können wir feststellen, dass dieses Protokoll alle UVP SVs entlädt, im Einvernehmen mit dem Studium in Hippocampus-Neuronen 16. Die Reserve-Pool ist fast vollständig von drei Züge von 400 Stimuli (40 Hz 10 s jeweils), da diese Stimulation entlädt eine identische Menge an Farbstoff zu einem Paradigmenwechsel (2 Reize mit 50 mM KCl), dass 95% aller Farbstoff-markierten SVs erschöpft erschöpft 8,17. Genaue Quantifizierung der Größe sowohl der UVP und Reserve-Pool ist auch abhängig von den Erwerb von Informationen innerhalb des linearen dynamischen Bereich der CCD-Kamera.
Dieses einfache Protokoll kann auch weiter modifiziert werden. Die Stärke der Belastung Reize kann auch variiert werden, um festzustellen, wie neuronale Aktivität und verschiedene Endozytose Modi beeinflussen SV Pool Nachschub werden. Darüber hinaus können mehr als zwei Zyklen von Be-und Entladen auch durchgeführt werden, wenn erforderlich. Dieses Protokoll kann auch in Zellen entweder mit Überexpression oder transfiziert werdenshRNA-Vektoren. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz der primären neuronalen Kulturen, müssen exprimierten Proteine mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Es ist wichtig, dass diese fluoreszierenden Markierungen nicht mit dem FM-Signal stören Farbstoff (Verwendung Cyan und Rot-Proteine, zum Beispiel). In diesem Fall kann Nervenendigungen von transfizierten und nicht transfizierten Zellen in der gleichen Sichtfeld auch als eine zusätzliche Steuerung 8 verglichen werden. In solchen Experimenten ein Vergleich des Ausmaßes der Belastung zwischen S1 und S2 Lasten ist von geringem Wert, da die Störung während der beiden Belastungen zu präsentieren. Partitionierung des Farbstoffs zwischen SV-Pools können noch jedoch 8 visualisiert werden.
Genetische Reporter namens pHluorins auch eingesetzt, um SV Exozytose und Endozytose in primären neuronalen Kultur zu überwachen. Diese Sonden mit einem pH-sensitive grün fluoreszierendes Protein, um den pH-Umfeld luminalen Domänen der markierten SV Proteine wie VAMP, Synaptophysin und VGLUT1 18 </sup>. In Verbindung mit vesikuläre ATPase-Inhibitoren eingesetzt wird, kann pHluorins Bericht sowohl die Kinetik und das Ausmaß der SV Pool Mobilisierung 19. Die FM-Farbstoff hier beschriebene Ansatz hat einige Vorteile gegenüber dem pHluorin Technik Erstens bieten FM Farbstoffe Informationen über die SV Endozytose-Modus füllt die RRP und Reserve-Pools 8. Zweitens spezifische SV-Pools können mit FM-Farbstoffe, die unterschiedliche spektrale Eigenschaften haben 20 und schließlich gibt es keine Anforderung für die Transfektion bezeichnet werden. FM Farbstoffe können keine Informationen über SV-Verkehr zwischen der Rast-und Recycling-SV-Pools jedoch (im Gegensatz zu pHluorins 19), da per Definition SVs mit Farbstoff während der Endozytose zu sehen sein geladen werden müssen. So auch FM Farbstoffe und pHluorins haben Stärken und Schwächen und mächtigsten, wenn in unabhängigen Experimenten verwendet, um die gleiche Frage zu stellen.
Qualitativ hochwertige Bilder sind für valide Analyse und reproducib wesentlichele Ergebnisse. Während horizontale Drift leicht korrigiert werden kann, können Experimente, in denen es einen Drift in der Z-Achse nicht wiederhergestellt werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, wieder unscharfe Bilder vor Beginn der S1 und S2 entlädt. In Fällen, in denen eine signifikante Fluoreszenz-Zerfall stattgefunden hat, kann Zerfallskorrekturen angewendet (in der Regel durch Abzug einer zuvor aufgezeichneten Spuren von FM-beladenen Zellen in der Abwesenheit von Stimulation) werden. Allerdings wird vorgeschlagen, dass Karies Korrektur ist nur für die grafische Darstellung und nicht für jede quantitative Analyse verwendet werden durchgeführt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Wellcome Trust (: 084277 Ref) unterstützt.
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)