FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ
Summary
このビデオでは、FlexStation 3を用いて、ヒトTRPA1チャネルの薬理学的特性を研究するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコルは、細胞調製、染料ロードとマイクロプレートリーダー、FlexStation 3の動作の詳細について説明します。
Abstract
分子デバイス"FlexStation 3は、マルチウェルプレートの自動蛍光測定が可能な卓上型マルチモードマイクロプレートリーダーです。それは学術的設定の中〜高スループットスクリーン用に最適です。それは、マルチチャンネルピペッターやマシンを装備した統合型流体転送モジュールは、蛍光試薬の様々な蛍光の変化を監視するために一度に1列を読み取りますいます。例えば、FlexStation 3 +透過性のイオンチャンネルとGタンパク質共役型受容体細胞内遊離Ca 2 +濃度の変化を測定することにより、Ca 2 +の機能を研究するために使用されています。一過性受容体電位（TRP）チャネルは、多くの生理学的および病態生理学的機能に重要な役割を果たす非選択的カチオンチャネルの大きなファミリーです。 TRPチャネルのほとんどはカルシウム透過性であると活性化によりカルシウム流入を引き起こす。このビデオでは、我々はTRPA1チャネル、多数の有害な刺激のための分子センサーの薬理学的特性を研究するためにFlexStation 3のアプリケーションを示しています。 96ウェルプレートで培養一過性または安定的に人間のTRPA1チャネルを発現するHEK293細胞を、、のCa 2 +感受性蛍光色素、みたFluo – 4にロードされ、そしてこれらの細胞のリアルタイム蛍光の変化はのアプリケーションの実行前と実行中に測定されていますFlexStation 3のFLEXモードを使用して、TRPA1アゴニスト。推定されるTRPA1拮抗薬の効果についても検討した。データは、TRPA1活性化因子と阻害剤の濃度 – 反応関係を構築するためにSoftMax Proソフトウェアから転送されます。
Protocol
Discussion
細胞内Ca 2 +などの神経伝達物質放出（3）、心臓の活動電位（4）、筋細胞の収縮（5）、細胞のシグナル伝達（6-7）、と興奮細胞死（のような多くの生理学的および病理学的条件下において重要な役割を果たしている8）。細胞内Ca 2 +濃度の測定は、機能+透過チャネルが細胞膜や細胞内小器官のCa 2 +の変化との寄与を解明するのに役立ちます
上記のプロセス…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、博士に感謝する。ジョンハンコック、レイグリル、アンドリューモリスとその支援のためのオルガChumakova。 FlexStation 3システムはUTHSC Cytodynamicイメージング施設の一部です。我々はまた、博士に感謝します。スクリップス研究所とHEK293 – hTRPA1安定した細胞株を提供するためのノバルティス研究財団（GNF）のゲノム研究所からArdem PatapoutianとマイケルBandell。研究は、NIH（MXZにGM081658）とテキサスメディカルセンター消化器病センター（HH）およびミッション接続/ TIRR財団（HHまで）からの助成金によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
Referências
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