Количественный и анализ формирования HO-эндонуклеаза Вынужденное Хромосомные транслокации по однонитевые Отжиг в Saccharomyces CEREVISIAE</em

Summary

HO-стимулированных транслокации анализа мониторы однонитевые отжига после создания ДНК двунитевых разрывов на нескольких локусов у диплоидных<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>. Этот механизм может быть модель перестройки генома в соматических клетках высших эукариот после воздействия больших доз ионизирующего излучения.

Abstract

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every eukaryotic genome. This process is an important mechanism for generating diversity between and within organisms^1-3. The human genome consists of approximately 40% repetitive sequence of retrotransposon origin, including a variety of LINEs and SINEs⁴. Exchange events between these repetitive elements can lead to genome rearrangements, including translocations, that can disrupt gene dosage and expression that can result in autoimmune and cardiovascular diseases⁵, as well as cancer in humans^6-9.

Exchange between repetitive elements occurs in a variety of ways. Exchange between sequences that share perfect (or near-perfect) homology occurs by a process called homologous recombination (HR). By contrast, non-homologous end joining (NHEJ) uses little-or-no sequence homology for exchange^10,11. The primary purpose of HR, in mitotic cells, is to repair double-strand breaks (DSBs) generated endogenously by aberrant DNA replication and oxidative lesions, or by exposure to ionizing radiation (IR), and other exogenous DNA damaging agents.

In the assay described here, DSBs are simultaneously created bordering recombination substrates at two different chromosomal loci in diploid cells by a galactose-inducible HO-endonuclease (Figure 1). The repair of the broken chromosomes generates chromosomal translocations by single strand annealing (SSA), a process where homologous sequences adjacent to the chromosome ends are covalently joined subsequent to annealing. One of the substrates, his3-Δ3′, contains a 3′ truncated HIS3 allele and is located on one copy of chromosome XV at the native HIS3 locus. The second substrate, his3-Δ5′, is located at the LEU2 locus on one copy of chromosome III, and contains a 5′ truncated HIS3 allele. Both substrates are flanked by a HO endonuclease recognition site that can be targeted for incision by HO-endonuclease. HO endonuclease recognition sites native to the MAT locus, on both copies of chromosome III, have been deleted in all strains. This prevents interaction between the recombination substrates and other broken chromosome ends from interfering in the assay. The KAN-MX-marked galactose-inducible HO endonuclease expression cassette is inserted at the TRP1 locus on chromosome IV. The substrates share 311 bp or 60 bp of the HIS3 coding sequence that can be used by the HR machinery for repair by SSA. Cells that use these substrates to repair broken chromosomes by HR form an intact HIS3 allele and a tXV::III chromosomal translocation that can be selected for by the ability to grow on medium lacking histidine (Figure 2A). Translocation frequency by HR is calculated by dividing the number of histidine prototrophic colonies that arise on selective medium by the total number of viable cells that arise after plating appropriate dilutions onto non-selective medium (Figure 2B). A variety of DNA repair mutants have been used to study the genetic control of translocation formation by SSA using this system^12-14.

Protocol

1. HO-стимулированных частоты транслокаций Привить 10-20 независимых 1 мл культуры YPGly / Lac среде (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 3% глицерина и 3% лактата) с одной колонии желаемого генотипа. Инкубируйте культур на ночь, или на время, достаточное для достижения плотности клеток приблизительно 5×10 1×10 7-8 клеток / мл, при 30 ° С на поворотное устройство, или с нежным агитации. Добавить галактозы к культурам, чтобы конечная концентрация 2%, чтобы вызвать HO эндонуклеазы направленной на ДР his3-Δ3 (хромосома III) и his3-Δ5 '(хромосомы XV) транслокация субстратов. Инкубируйте в течение 4 часов при температуре 30 ° С на ротатор, или с нежным агитации. Через 4 часа, плиты соответствующего разведения культур на YPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% раствором декстрозы), чтобы получить примерно от 100 до 200 колоний на пластину, и достаточное количество клеток на среде гистидина не хватает для получения наблюдаемых число его + рекомбинантный колоний. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение двух-трех дней. ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1,4 описывает определение транслокации частот при селективных условиях при посеве культур на среду отсутствуют гистидина. Этот анализ также может проводиться под неселективных условиях при посеве культур на YPD, а затем реплики-покрытие колоний, которые возникают на его пластинах-два-три дня позже. Эти методы дают аналогичные частоты транслокации (рис. 2С). Определить частоту перемещения путем деления числа колоний гистидина прототрофный на общее количество жизнеспособных клеток покрытием (определяется при посеве разведений на YPD). Определить среднюю частоту перемещения и 95% доверительный интервал 15. 2. Покрытие эффективности Удалить аликвоту клеток из каждой ночной культуры, и определить номер ячейки по hemacytometer счетчик (Baxter Healthcare корпорации Catolog #:. B3178-1). Пластина примерно от 100 до 200 ячеек с помощью соответствующего разбавления на YPD. Инкубируйте в течение двух-трех дней при температуре 30 ° C (например, для культуры плотности клеток 1×10 8 кл / мл, следует пластина 100-200 мкл разведения 10-5 на чашку). Добавить 20% галактозы к культурам до конечной концентрации 2%. Через 4 часа, удалить аликвоту клеток из каждой культуры, определить число клеток по hemacytometer считать, а плита примерно от 100 до 200 ячеек с помощью соответствующего разбавления на YPD. Инкубируйте в течение двух-трех дней при температуре 30 ° C. Определить эффективность покрытия путем деления числа колоний, появляющиеся на YPD по числу посеянных клеток и умножая этот фактор на 100. Определить средний процент с 95% доверительный интервал. 3. Геномная Южно-блот-анализа Выберите одну Его + рекомбинантный колонии от каждого независимого судебного разбирательства и подготовить геномной ДНК 16. Дайджест около 4 мкг ДНК с рестриктазой BamHI. Отдельные фрагменты BamHI усваивается на 0,7% агарозном геле, и трансфер в положительно заряженные нейлоновой мембраны (Hybond N +, GE Healthcare Код продукта:. RPN303B) 17. Скрещиваться с 32 Р-меченым зондом получить случайную грунтовки (Amersham Biosciences Код продукта:. RPN1604) с 1,8 кб BamHI / BamHI геномный клон, содержащий HIS3 гена. Визуализация фрагментов ДНК авторадиографией или phosphorimaging. 4. Хромосома блот анализа с использованием хромосомы разделены в контур-зажаты однородном электрическом поле (шеф-повар): Подготовка хромосомы от выбранного + Его рекомбинантов в пробки агарозном 18: Расти жидкости культуры Его + кандидата ТРВ:: III хромосоме содержащих рекомбинантный в 5 мл YPD примерно 1-2 х 10 8 клеток / мл. Спином вниз и промыть клетки 2 раза 50 мМ ЭДТА. Ресуспендируют клетки примерно в 200 мкл 50 мМ ЭДТА, и теплой до 50 ° C. Добавить равный объем расплавленного 2% (м / о) низкая расплава агарозном доведено до 50 ° С, тщательно перемешать. Внесите примерно 80 мкл аликвоты в разъем пресс-формы, и дать им остыть в течение 30 мин при 4 ° C. Extrude пробки из формы в 12-и блюдо. До пяти пробки могут быть помещены в каждую лунку. Добавьте 3 мл свежеприготовленного spheroplasting решение (14 мМ 2-β-меркаптоэтанола, 20 мМ ЭДТА, 0,5 мг / мл Zymolyase 20T, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М сорбит) в каждую лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов с нежным агитации. Удалить spheroplasting решение и заменить 3 мл LDS решения (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ ЭДТА, 1% (м / о) литий додецилсульфата, adjusт рН до 8,0). Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин при легком помешивании. Удалить LDS решение и заменить еще 3 мл аликвоту LDS. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи с нежным агитации. Удалить LDS и заменить с 3 мл 0,2 X NDS (0,6 г трис базы, 93 г динатрия ЭДТА дигидрат, 5 г N-лауроил саркозин, отрегулировать рН до 8,0, доведено до 500 мл с дН 2 O). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин при легком помешивании. Удалить NDS, и повторить 2 раза. Удалить NDS и заменить 3 мл TE. Промыть легком помешивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторить 4 раза. Магазин пробки при 4 ° С в 2 мл TE. Вилки могут держать на срок до года. Отдельные хромосом на 1% агарозном геле использованием Bio-Rad CHEF-DRII аппарата при 14 ° С (Catalog #: 170-3612). Параметры: 1-й блок: 70 реле времени, 15 ч при 6V/cm. 2-й блок: 120 с реле времени, 11h на 6V/cm Визуализируйте хромосом окрашиванием 1μg/ml бромистый этидий в течение 30 мин, облучение с 60 мДж ультрафиолетового в УФ Stratalinker (Stratagene), и де-окрашивания в течение 30 мин в дН 2 O. Облучение бромистый этидий окрашенных хромосом ники ДНК, чтобы обеспечить эффективную передачу к мембране. Передача хромосом к положительно заряженной мембраной (Hybond N +, GE Healthcare Код продукта:. RPN303B) под действием капиллярных сил в денатурирующих условиях (0.4N NaOH, 1,5 М NaCl). Скрещиваться с 32 Р-меченым зондом получить случайную грунтовки (Amersham Biosciences Код продукта:. RPN1604) с 1,8 кб BamHI / BamHI геномный клон, содержащий ген HIS3 17. Визуализируйте хромосом авторадиографией или phosphorimaging. 5. Представитель Результаты: Графическое представление анализа транслокации изображен на хромосомном уровне (рисунок 1). Схема экспериментальной процедуры также отображается (рис. 2А). И до и после индукции эффективность покрытия определяется путем деления общего числа жизнеспособных, колониеобразующих клеток общее количество клеточных тел в культуре определяется hemacytometer счет (рис. 4В). Пре-и пост-индукционной эффективность покрытия существенно не различались для дикого типа клеток (р-значение = 0,1400) (табл. 1). Таблица 1. Пре-и пост-индукции покрытие эффективности в дикого типа клеток. Число клеточных тел в миллилитре определяются hemacytometer счет. б количество жизнеспособных клеток на миллилитр определяются покрытие соответствующих разведений на неселективные среды для производства ~ 100-200 колоний. с пре-и пост-индукционной эффективность покрытия определяется путем деления общего числа жизнеспособных, формирования колонии, клетки на общее количество клеточных тел в культуре, определяется hemacytometer счет. Это говорит о том, что наличие или отсутствие либо транслокация хромосомы не влияет на способность к выживанию DSB образования. Частота хромосомных транслокаций могут быть рассчитаны путем деления числа колоний гистидина прототрофный на общее количество жизнеспособных клеток определяется при посеве на YPD (рис. 2В). Этот анализ может быть проведен с использованием штаммов различных генотипов чтобы определить, как потеря функции белка влияет SSA (т.е. rad51Δ – / -). Рекомбинация частот определяется в различные штаммы могут быть графически сравнить различия в способности этих штаммов для ремонта HO-эндонуклеазы индуцированных ДР по SSA (рис. 2С). Перемещение частоты, полученные с диким типом диплоидных деформации при селективной (2.2×10 -2) и неселективные (2.17×10 -2) условия не были статистически отличаются друг от друга (р-значение = 0,9131), а транслокации частоты, полученные выборочно (6.0×10 -2) и не выборочно (11.9×10 -2) с rad51Δ – / – гомозиготы были похожи, но статистически различными (р-значение = 0,0089). Частоты получены как выборочно (р-значение = 0,0001) и не выборочно (р-значение = 0,0002) с RAD51 ° – / – гомозиготы были статистически отличаются от тех, полученные с помощью соответствующих условий с штаммом дикого типа. Предполагаемые перемещение несущих клоны могут быть дополнительно рассмотрены геномной Южной пятно и хромосомные анализы пятно (рис. 3). Для Южной анализа, геномной ДНК переваривается с BamHI эндонуклеазы до электрофореза в агарозном геле, блоттинга и гибридизации с 32P-меченых 1.8kb HIS3 зонд для визуализации диагностических 0,8 кб his3Δ200, 1,7 кб his3-Δ3 ', 4 кб tIII:: XV, 5 кб ТРВ:: III, и 8 кб his3-Δ5 "фрагментов (рис. 3b.1) . Неповрежденная хромосом могут быть получены, разделенных CHEF (рис. 3b.2), уничтожены до нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации 1.1 Mb нетронутыми хромосомы XV, 0,8 Mb ТРВ: III транслокация хромосомы, 0,6 Mb tIII: XV транслокация хромосомы, и 0,3 Mb нетронутыми хромосоме III (рис. 3b.3). Графическим изображением карты ожидается BamHI эндонуклеазы-переваренной геномной ДНК-фрагментов, а также родителей и рекомбинантных хромосом, изображен (рис. 3А). Рисунок 1. Формирование транслокации хромосом однонитевые отжига (SSA). 1) ДР создаются на his3-Δ3 и his3-Δ5 'субстратов (хромосом XV и III, соответственно) эндонуклеазой HO после добавления галактозы в культурах. 2) ДР обрабатываются для получения 3 'одной нити на концах хромосом сломанной. 3) SSA отжигов техники дополнительных 311 или 60 нуклеотидных одноцепочечной HIS3 последовательностей, сформированных в каждом из рекомбинации субстратов. Негомологичными хвосты, образующиеся при отжиге снимаются эндонуклеазой пищеварения. Дополнительные четыре б.п. свесы на оставшихся хромосомные фрагменты образована HO-эндонуклеазы пищеварения может также отжига. 4) Лигирование завершается создание нетронутыми HIS3 гена и ТРВ:: III транслокация хромосомы по SSA. Клетки проведения этой хромосомы могут быть выбраны для их способность расти на среде отсутствует гистидина. Лигирование может также привести к обратному tIII:: XV транслокация хромосомы от NHEJ-подобный механизм. Рисунок 2. Тест для определения частоты перемещения по SSA.) Один мл YPGly / Lac культурами засевают одной колонии клеток выберите генотипа и выросли до соответствующей плотности примерно 5×10 1×10 7-8 клеток / мл. Галактоза добавляется к конечной концентрации 2% для создания ДР на рекомбинацию субстратов на хромосомах III и XV. Для проведения анализа в селективных условиях, соответствующих разведений сделаны так, что приблизительно от 100 до 200 клеток высевали на YPD и достаточное количество клеток высевали на среду отсутствуют гистидина уступить наблюдаемым числом Его + рекомбинантных колоний. Для проведения анализа без отбора, примерно от 100 до 200 Клетки высевали на YPD, выращенные в течение двух-трех дней до одной колонии, а затем реплики высевали на среду отсутствуют гистидина. Б) транслокации частота может быть определена путем деления числа колоний, которые растут на его пластинах по доле, которые растут на YPD. С) транслокация частоты штаммов различных генотипов (т.е. дикого типа и rad51Δ – / -) можно графически сравнить различия в способности этих штаммов для ремонта ДР по SSA. Рисунок 3. Определение эффективности покрытия. () Аликвоту клеток, взятых из ночной культуры до и после DSB индукции, соответствующих разведений сделаны, а затем hemacytometer счет, чтобы определить общее количество клеточных тел на мл культуры. Соответствующие разведения высевают на неселективные среды, чтобы определить общее количество жизнеспособных клеток на миллилитр, путем подсчета колоний, которые появляются на YPD. (Б) покрытие эффективности в этом случае определяется путем деления общего числа жизнеспособных клеток общее количество клеточных тел, и этот фактор умножения на 100. Рисунок 4. Обнаружение хромосомных транслокаций событий по геномной Южной пятно и анализирует хромосомы пятно. ) Графическое представление соответствующих хромосом до (слева) и после (справа) транслокация образования. Размеры материнской и рекомбинантных хромосом перечислены в megabase-пар (Мб). Размеры рестрикционных фрагментов, содержащих соответствующие последовательности, порожденные BamHI переваривания геномной ДНК от родителей и рекомбинантных штаммов, и показал на пятна путем гибридизации с 1,8 кб BamHI HIS3 геномный клон, перечислены в kilobase-пар (кб). Хромосомы не в масштабе. Б) Физические анализ предполагаемого перемещения несущих клонов. (1) Геномная Южно-блот-анализ – Геномная ДНК была собрана и расщепляют рестриктазой BamHI, фракционированного помощью гель-электрофореза, Блоtted для нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации следующие фрагменты: 0,8 кб his3Δ200, 1,7 кб his3-Δ3 ', 4 кб tIII:: XV, 5 кб ТРВ:: III, и 8 кб his3-Δ5. Дорожки:) родителя диплоидных, б) Его + невзаимных транслокации рекомбинантного, в) Его + взаимные транслокации рекомбинантного. (2) CHEF гели – неповрежденной хромосомы были подготовлены в пробки агарозы, разделенных CHEF, окрашивали бромистого этидия и визуализируется в УФ-свете. Дорожки: Как и выше. (3) Хромосомные пятна – Отдельные хромосомы были уничтожены до нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации хромосом следующие: 1.1 Mb нетронутыми хромосомы XV, 0,8 Mb ТРВ: III транслокация хромосомы, 0,6 Mb tIII: XV транслокации хромосомы, и 0,3 Mb нетронутыми хромосоме III. Дорожки: Как и выше.

Discussion

Высокие дозы ионизирующего излучения настоящее неотъемлемый риск нестабильности генома через поколение большого количества ДР ^19. Эукариотических геномов изобилуют повторяющимися последовательностями, которые являются отличным субстратом для генерации транслокаций и других геномных перестройках ^20,21. Хромосомные транслокации по HR, часто наблюдается при ДР вводятся между повторяющимися последовательностями ^12,21,22. Подавляющее данные свидетельствуют о том, что большая часть геномной нестабильности, связанной с лейкозы и лимфомы может быть связано с хромосомной транслокации, подчеркнув важность понимания того, как этот механизм имеет место у эукариот ^22,23. Мы разработали систему, в почкующихся дрожжей для изучения образования транслокации хромосом DSB-индуцированной HR между краткосрочными регионов гомологии на разных хромосомах, которые близки по размерам к повторяющихся элементов, рассеянных по всему дрожжах и человеческих геномов.

В анализе, транслокации субстрата his3-Δ3 'находится на одной копии хромосомы XV. Другие his3 аллель (his3-Δ200) имеет ~ 1 КБ удаление HIS3 промотора и кодирующая последовательность, которая не позволяет этой последовательности от использования в качестве шаблона для ремонта ^24. Подложки his3-Δ5 "находится по адресу LEU2 локус на одну копию хромосомы III, с другой копии хромосомы III содержащие неизменным LEU2 аллели (рис. 1). Галактоза-индуцируемых HO эндонуклеазы выражение кассету, отмеченные KAN-MX был вставлен в TRP1 локусом хромосомы IV (TRP1:: GAL-HO-KAN-MX). Каждое перемещение подложки в окружении HO-эндонуклеазы узнаваемой последовательности, которые могут быть направлены для расщепления путем индукции экспрессии гена HO путем добавления галактозы в среде. После HO-эндонуклеазы индуцированных расщепление по his3-Δ3 и his3-Δ5 'субстраты, клетки могут эффективно использовать общие короткий тракт HIS3 последовательность гомологии (311 б.п. и 60 б.п.) для ремонта сломанной хромосом HR, генерируя транслокация хромосомы с нетронутыми HIS3 аллель ^12-14,25.

Потому что родитель клетки теряют нетронутой копией гена HIS3, они не могут расти на его среде. Только клетки, которые подверглись транслокации событие может быть выбрана для представления в среде отсутствуют гистидина. Таким образом, частота хромосомных транслокаций может быть вычислена путем деления числа колоний гистидина прототрофный на общее количество жизнеспособных клеток покрытием, определяется при посеве на YPD. Геномная ДНК и неповрежденной хромосомы может быть изолирован от представителя ⁺ своих колоний, а также наличие транслокации хромосом проверяется геномной Южной и анализирует хромосомы пятно.

Тщательный анализ позволил нам собрать дополнительную важную информацию о анализа ^12. Геномная Южно-блот-анализа предоставил доказательств того, что есть практически полная резки хромосом XV и III через 30 минут после HO-эндонуклеазы индукции, и, следовательно, нет значительного фона необработанных хромосомных субстратов в популяции (Г. Manthey & A. Bailis, неопубликованные результаты). Геномные и хромосомные Южной пятно анализы Его ^– означает, что выжившие клетки часто теряют один, другой, или как сокращение хромосом и остаются жизнеспособными (Л. А. Лидделл и Bailis, неопубликованные результаты). Важно отметить, что почти эквивалентно покрытие эффективности на неселективные среды до и после индукции экспрессии HO-эндонуклеазы указывает, что ни отсутствие ремонта сломанной хромосом, а также невозможность сохранить транслокация хромосомы влияет на способность к выживанию DSB образования. В соответствии с этим, ТРВ: III транслокации хромосом было показано, является нестабильным в митотических клеток в отсутствие выбора. Об этом свидетельствует растущее ТРВ:: III, содержащий его рекомбинантов ^{+ ночевка} неселективно, покрытие отдельных колоний на неселективные тарелки, и реплики покрытие на селективной среде отсутствует гистидина. От десяти до 70% колоний, возникающие на этих пластинах потерял ТРВ:: III транслокация хромосомы (Н. Pannunzio & A. Bailis, неопубликованные результаты).

Транслокации хромосом порожденных ИК воздействия на человека выставлять аналогичные нестабильности ^26. Это говорит о том, что транслокация образование может способствовать раннему событий в опухолей путем содействия потеря гетерозиготности. Во-вторых, обширные генетические и молекулярные анализы показывают, что SSA, эффективной и обязательно неконсервативных механизм управления персоналом, является основным механизмом транслокации Формирование HR следующие одновременное создание ДР на двух хромосом ^12,27,28. Это сотрудничествоnsistent с выводом, что большие дозы ИК привести к плотности ДР достаточно для создания перерывов рядом с нескольких повторяющихся последовательностей в геноме дрожжей, а также высокая частота транслокаций Формирование HR. Вместе, эти наблюдения позволяют предположить, что онкогенные эффект ИК воздействия на человека может, в частности, в результате ремонта ДР по эффективным механизмом, который генерирует HR транслокации, что благодаря их внутренней нестабильности, способствуют генетические изменения, которые запускают опухолей. Поскольку излучение часто используется для лечения рака, перестройки генома, возникающие в результате ремонта радиационных ДР может способствовать генерации вторичных раковых заболеваний, которые часто возникают у пациентов. Таким образом, эта модель может помочь нам получить лучшее понимание генетических и молекулярных основ важный клинический ответ на ИК-обработки.

Materials