HO-stimulerad translokation analys övervakar enkelsträngbrott glödgning efter bildandet av DNA dubbel-strängbrott på flera loci i diploid<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Denna mekanism kan modell genomet omdisponeringar i kroppsceller från högre eukaryoter efter exponering för höga doser av joniserande strålning.
Genetisk variation är ofta förmedlas av genomisk omdisponeringar som uppstår genom interaktion mellan spridda repetitiva element finns i alla eukaryota genomet. Denna process är en viktig mekanism för att generera mångfald inom och mellan organismer 1-3. Det mänskliga genomet består av cirka 40% repetitiva sekvensen av retrotransposon ursprung, inklusive olika linjer och SINES 4. Börsen händelser mellan dessa repetitiva element kan leda till arvsmassan omdisponeringar, inklusive translokationer, som kan störa gen dosering och uttryck som kan resultera i autoimmuna och hjärt-kärlsjukdomar 5, liksom cancer hos människor 6-9.
Utbyte mellan repetitiva element förekommer i en mängd olika sätt. Utbyte mellan sekvenser som aktien perfekt (eller nästan perfekt) homologi sker genom en process som kallas homolog rekombination (HR). Däremot icke-homologa slut att gå (NHEJ) använder små-eller-inget sekvenshomologi för utbyte 10,11. Det främsta syftet med HR i mitotiska celler, är att reparera dubbla strängbrott (DSBs) som genereras endogent med avvikande DNA-replikation och oxidativa skador, eller av exponering för joniserande strålning (IR) och andra exogena DNA-skada agenter.
I analysen beskrivs här, är DSBs samtidigt skapas gränsar rekombination substrat på två olika kromosomala loci i diploida celler av en galaktos-inducerbara HO-endonuclease (Figur 1). Reparation av trasiga kromosomer genererar kromosomala flyttning av sträng glödgning (SSA), är en process där homolog sekvenser i anslutning till kromosom ändarna kovalent gick efter glödgning. En av substrat, his3-Δ3 ", innehåller en 3" stympad HIS3 allel och ligger på ett exemplar av kromosom XV på infödda HIS3 locus. Den andra substrat, his3-Δ5 ", ligger vid LEU2 locus om ett exemplar av kromosom III, och innehåller en 5" stympad HIS3 allel. Båda substrat flankeras av en HO endonuclease erkännande webbplats som kan riktas till snitt av HO-endonuclease. HO endonuclease erkännande platser hemma i MAT locus, på båda kopiorna av kromosomen III har strukits i alla stammar. Detta hindrar samspelet mellan rekombination substrat och andra brutna ändar kromosom från inblandning i analysen. Det KAN-MX-märkt galaktos-inducerbara HO endonuclease uttryck kassett är isatt på TRP1 locus på kromosom IV. Det substrat aktien 311 bp och 60 bp i HIS3 kodande sekvens som kan användas av HR-maskiner för reparation av SSA. Celler som använder dessa substrat för att reparera trasiga kromosomer av HR bildar en intakt HIS3 allel och en tXV:: III kromosomal translokation som kan väljas för den förmåga att växa på medium saknas histidin (Figur 2A). Translokation frekvens av HR beräknas genom att dividera antalet histidin prototrophic kolonier som uppstår på selektivt medium med det totala antalet livskraftiga celler som uppstår efter bordläggning lämpliga spädningar på icke-selektivt medium (Figur 2B). En mängd olika mutanter DNA-reparation har använts för att studera den genetiska kontrollen av translokation bildande genom SSA med detta system 12-14.
Höga doser av joniserande strålning utgör en inneboende risk för genomet instabilitet genom produktion av ett stort antal DSBs 19. Eukaryota genom är fyllda med repetitiva sekvenser som är utmärkta substrat för att generera flyttning och andra omstruktureringar genomiska 20,21. Kromosomal flyttning av HR ofta iakttas vid DSBs införs mellan repetitiva sekvenser 12,21,22. Överväldigande bevis tyder på att mycket av genomisk instabilitet i samband med leukemi och lymfom kan hänföras till kromosomala translokationer, betonar vikten av att förstå hur denna mekanism sker i eukaryoter 22,23. Vi har utvecklat ett system i spirande jäst för att undersöka bildandet av translokation kromosomer DSB-inducerad HR mellan kort regioner homologi på olika kromosomer som liknar storleken på repetitiva element spridda över hela jäst och mänskliga genomet.
I analysen är his3-Δ3 flyttning substrat ligger på ett exemplar av kromosom XV. Den andra his3 allelen (his3-Δ200) har en ~ 1KB strykning av HIS3 promotor och kodning sekvens som förhindrar denna sekvens används som en mall för reparation 24. Den his3-Δ5 "substrat ligger vid LEU2 locus på ett exemplar av kromosom III, med andra exemplar av kromosom III innehåller en oförändrad LEU2 allelen (Figur 1). En galaktos-inducerbara HO endonuclease uttryck kassett märkt med KAN-MX infördes i TRP1 locus i kromosom IV (trp1:: GAL-HO-kan-MX). Varje translokation substrat flankeras av ett HO-endonuclease erkännande sekvens som kan riktas för klyvning genom att inducera uttryck av HO-genen genom tillägg av galaktos till mediet. Efter HO-endonuclease inducerad spjälkning vid his3-Δ3 "och his3-Δ5" substrat, kan celler använder effektivt den delade korta tarmkanalen av HIS3 sekvenshomologi (311 bp eller 60 BP) för att reparera den trasiga kromosomer av HR, vilket genererar en translokation kromosom med en intakt HIS3 allel 12-14,25.
Eftersom föräldern celler saknar en intakt kopia av den HIS3 gen, de är oförmögna att växa på sitt medium. Endast celler som har genomgått den translokation evenemanget kan väljas på medellång saknas histidin. Därför kan frekvensen av kromosomavvikelser translokationer beräknas genom att dividera antalet kolonier histidin prototrophic med det totala antalet livskraftiga celler pläterade, bestäms av bordläggningen på YPD. Genomiska DNA och intakta kromosomer kan sedan isoleras från representativa Hans + kolonier, och närvaron av en translokation kromosom verifieras av genomiska södra och kromosom analyser blot.
Noggrann analys har gett oss möjlighet att samla in ytterligare viktig information om analysen 12. Genomic Southern blot-analys har gett bevis för att det är praktiskt taget fullständig skärning av kromosomer XV och III efter 30 minuter av HO-endonuclease induktion, och därför finns det ingen betydande bakgrund av oklippt kromosomala substrat i befolkningen (G. Manthey & A. Bailis, opublicerade resultat). Genomisk Södra och kromosom blot analyser av Hans – överlevare indikerar att cellerna ofta förlorar en, den andra, eller båda kromosomerna klippa och förbli lönsamma (L. Liddell & A. Bailis, opublicerade resultat). Viktigt är de nästan lika bordläggning effektivitet på icke-selektivt medium före och efter induktion av uttryck av HO-endonuclease visar att varken fel att reparera trasiga kromosomer, eller underlåtenhet att behålla translokation kromosomerna påverkar förmågan att överleva DSB bildas. I överensstämmelse med detta, tXV: III translokation kromosom har visat sig vara instabil i mitotiska celler i frånvaro av valet. Detta visades genom att växa tXV:: III innehåller Hans + rekombinanter natten icke-selektivt, plätering enstaka kolonier på icke-selektiva plattor, och replik plätering på selektivt medium saknas histidin. Tio till 70% av de kolonier som uppstår på dessa plåtar hade förlorat tXV:: III translokation kromosom (N. Pannunzio & A. Bailis, opublicerade resultat).
Translokation kromosomer som genereras av IR-exponeringen hos människa uppvisar en liknande instabilitet 26. Detta tyder på att translokation bildningen kan bidra till tidig händelser i Tumörgenesens genom att främja förlust av heterozygositet. För det andra, omfattande genetiska och molekylära analyser tyder på att SSA, är en effektiv och obligatoriskt icke-konservativa mekanism HR, den primära mekanismen för translokation bildandet av HR efter samtidiga bildandet av DSBs på två kromosomer 12,27,28. Detta samarbetensistent med konstaterandet att stora doser av IR resultera i en täthet av DSBs tillräckligt för att skapa pauser i anslutning till flera repetitiva sekvenser i jästgenomet och en hög frekvens av translokation bildandet av HR. Tillsammans utgör dessa observationer tyder på att onkogena effekten av IR-exponeringen hos människa kan, delvis en följd av reparation av DSBs av en effektiv mekanism för HR som genererar translokationer som genom sina inneboende instabilitet, främja genetiska förändringar som lanseras Tumörgenesens. Eftersom strålning används ofta för att behandla cancer, genomet omflyttningar som beror på reparationer av strålningsinducerad DSBs kan bidra till uppkomsten av sekundär cancer som uppkommer ofta hos patienter. Således kan denna modell hjälpa oss att få en bättre förståelse av de genetiska och molekylära grunden för ett viktigt kliniskt svar till IR-behandling.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från National Institutes of Health och Beckman forskningsinstitut City of Hope. Vi vill tacka granskarna för deras konstruktiva kommentarer som läggs klarhet till manuskriptet.