Préparation de l'ADN viral à partir des nucléocapsides

Summary

Nous décrivons le processus d'isolation de haute pureté nucléocapside herpèsvirus ADN à partir de cellules infectées. L'ADN capturé finale de la solution est de forte concentration et de pureté, qui le rend idéal pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections pour produire de nouveaux virus recombinants.

Abstract

Les virus sont des parasites cellulaires, et donc l'étude de leur ADN nécessite un matériau isolant virale loin de contaminants de la cellule hôte et de l'ADN. Plusieurs applications en aval nécessitent de grandes quantités d'ADN viral pur, qui est prévue par le présent protocole. Ces applications comprennent le séquençage du génome viral, où la suppression de l'ADN hôte est cruciale pour optimiser la production de données pour les séquences virales, et la production de nouvelles souches virales recombinantes, où la co-transfection de plasmide purifié et linéaire d'ADN viral facilite la recombinaison. ^{1,2, 3}

Cette procédure utilise une combinaison d'extractions et de densité à base de centrifugation afin d'isoler l'ADN purifié herpèsvirus linéaire nucléocapside à partir de cellules infectées. ^4,5 Les premières étapes de purification pour but d'isoler capsides virales purifiées, qui contient et protège l'ADN viral au cours de l'extraction et les étapes de centrifugation qui éliminent les protéines cellulaires et l'ADN. Lyse des nucleocapsides libère alors l'ADN viral, et deux finales de phénol-chloroforme étapes éliminer les protéines restantes. L'ADN capturé finale de la solution est très concentré et pur, avec une moyenne DO _260/280 de 1,90. En fonction de la quantité de cellules infectées utilisées, les rendements de l'ADN viral gamme de 150 à 800 mg ou plus. La pureté de cet ADN, il est stable pendant un stockage prolongé à 4 ° C. Cet ADN est donc parfaitement adapté pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections.

Avant de commencer le protocole, il est important de connaître le nombre moyen de cellules par boîte (par exemple, une moyenne de 8 x 10 ⁶ cellules PK-15 confluentes dans un plat de 15 cm), et le titre du stock viral à utiliser ( par exemple 1 x 10 ⁸ unités formant des plages par ml). Ceux-ci sont nécessaires pour calculer la multiplicité appropriée d'infection (MOI) pour le protocole. ⁶ Par exemple, pour infecter une de 15 cm plat de cellules PK-15 avec le stock au-dessus virale, àune MOI de 5, vous pouvez utiliser 400 ul de stock viral et le diluer avec 3,6 ml de milieu (volume inoculation total de 4 ml pour une plaque de 15 cm).

Plusieurs préparations d'ADN viraux peuvent être préparés en même temps. Le nombre de préparations simultanées n'est limité que par le nombre de tubes détenus par le rotor ultracentrifugeuse (un par le virus; voir l'étape 3.9 ci-dessous). Nous décrivons ici la procédure comme si elle était faite pour un virus.

Protocol

1. Premier jour: Infection virale et la préparation des tampons Préparez des plats 5-10 (15 cm de diamètre) de cellules de culture tissulaire de l'infection, par exemple cellules PK-15 pour le virus de la pseudo-rage (PRV) ou des cellules Vero pour l'herpès simplex virus (HSV). Lorsque les cellules sont de 95 – 100% de confluence, les infecter à un (MOI) de 5-10. Pour ce faire, inoculer chaque plaque en utilisant stock de virus dans un volume total de 4 ml par plaque, puis incuber les p…

Discussion

Certaines parties de ce protocole ont été initialement développées pour l'isolement d'ADN viral dans des conditions de biosécurité L4, mais elle s'adapte aussi bien aux non-BSL conditions. ⁴ Nous communément utiliser ce protocole pour isoler l'ADN du PRV alpha-herpèsvirus et le HSV-1, qui possèdent des génomes d'ADN enfermé dans une capside protéique et entouré par une enveloppe lipidique. ^7,8 Cependant, il est probable directement adaptable à d'autres virus à…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane)	Fisher	T178-4	Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9
Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity	5 PRIME	2302850	Optional
Polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman*	331372*	*Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only
NP-40 / IGEPAL	Sigma	I-3021
PK-15 cells	ATCC	CCL-33
Vero cells	ATCC	CCL-81
PBS	HyClone	SH30028.03