Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside
Summary
Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.
Abstract
Viren sind obligate Parasiten zellulären und damit die Untersuchung ihrer DNA erfordert Isolierung viraler Material vom Wirtszelle Verunreinigungen und DNA. Mehrere nachgelagerten Anwendungen erfordern große Mengen an reiner viraler DNA, die durch dieses Protokoll vorgesehen ist. Zu diesen Anwendungen zählen virale Genom-Sequenzierung, in denen die Beseitigung der Wirts-DNA ist entscheidend für die Datenausgabe für virale Sequenzen zu optimieren und die Produktion neuer viraler rekombinanten Stämmen, wo Co-Transfektion von gereinigter Plasmid-und lineare virale DNA erleichtert Rekombination. 1,2, 3
Dieses Verfahren verwendet eine Kombination von Extraktionen und Dichte-basierte Zentrifugieren zu isolieren gereinigten linearen Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. 4,5 Die ersten Reinigungsschritte Ziel gereinigten viralen Kapside zu isolieren, die enthalten und schützen die virale DNA während der Extraktion und Zentrifugationsschritte dass zelluläre Proteine und DNA zu entfernen. Lysis von Nukleokapside gibt dann die virale DNA, und zwei abschließende Phenol-Chloroform Schritte entfernen verbleibenden Proteine. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist hoch konzentriert und rein, mit einer durchschnittlichen OD 260/280 von 1,90. Je nach der Menge der infizierten Zellen verwendet, die Erträge der viralen DNA-Bereich von 150 bis 800 ug oder mehr. Die Reinheit dieser DNA macht es stabil während der Langzeit-Lagerung bei 4C. Diese DNA ist somit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen geeignet.
Vor Beginn des Protokolls, ist es wichtig, die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Schale (z. B. durchschnittlich 8 x 10 6 PK-15-Zellen in einer konfluenten 15 cm Schale), und der Titer der viralen Lager verwendet werden wissen ( zB 1 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten pro ml). Diese sind notwendig, um die entsprechende Multiplizität der Infektion (MOI) für das Protokoll zu berechnen. 6 Zum Beispiel, um eine 15 cm Schüssel mit PK-15-Zellen mit den oben genannten viralen Lager, bei einer MOI von 5 infiziert, würden Sie 400 ul viralen Lager und verdünnen Sie es mit 3,6 ml Medium (insgesamt Impfung Volumen von 4 ml für eine 15 cm-Platte).
Mehrere virale DNA-Präparate können zur gleichen Zeit vorbereitet werden. Die Anzahl der gleichzeitigen Vorbereitung ist nur durch die Anzahl der Rohre durch die Ultrazentrifuge Rotor statt Limited (einer pro-Virus; siehe Schritt 3,9 unten). Hier beschreiben wir das Verfahren, als ob die für einen Virus getan.
Protocol
Discussion
Teile dieses Protokoll wurden ursprünglich für die virale DNA-Isolierung in BSL4 Bedingungen entwickelt, aber es passt ebenso gut auf nicht-BSL Bedingungen. 4 Wir verwenden häufig dieses Protokoll, um DNA aus den Alpha-Herpesviren PRV und HSV-1, das DNA-Genome sind zu isolieren eingeschlossen in einem proteinhaltigen Kapsid, umgeben von einer Lipid-Hülle. 7,8 Jedoch ist es wahrscheinlich, direkt anpassungsfähig zu anderen großen DNA-Viren, wie zB Beta-und Gamma-Herpesviren und Adenoviren. Äh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren schätzen die Beiträge Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, und die Mitglieder des Enquist Labor in die Feinabstimmung dieses Protokoll.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
Referências
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
