माउस भ्रूण के लिए एक ethylene glycol आधारित कांच में रूपांतर विधि वर्णित है. यह अपनी सादगी और कम भ्रूण विषाक्तता में अन्य तरीकों के लिए फायदेमंद है, और इसलिए मोटे तौर पर चूहों के जन्मजात और जीन संशोधित चूहों सहित कई उपभेदों, के लिए लागू किया जा सकता है.
माउस भ्रूण की cryopreservation एक तकनीकी आधार है कि जैव चिकित्सा विज्ञान का समर्थन करता है, क्योंकि चूहों के कई उपभेदों आनुवंशिक संशोधनों द्वारा निर्मित किया गया है और संख्या लगातार वर्ष द्वारा वर्ष बढ़ रही है. इसके तकनीकी विकास 1970 के दशक के एक में धीमी गति से ठंड तरीकों के साथ शुरू किया, तो कांच में रूपांतर देर से 1980 2 में विकसित तरीकों के द्वारा पीछा किया. आम तौर पर, उत्तरार्द्ध तकनीक अपने वेग, सादगी, और बरामद भ्रूण के उच्च survivability में फायदेमंद है. हालांकि, निहित cryoprotectants बेहद जहरीला कर रहे हैं और बाद में भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकता है. इसलिए, इस तकनीक चूहों के कुछ उपभेदों के लिए लागू नहीं किया गया था जब भी समाधान 4 करने के लिए ठंडा कर रहे हैं ° C भ्रूण से निपटने के दौरान विषाक्त प्रभाव कम करने के लिए. आरआईकेईएन BioResource केंद्र में 5000 से अधिक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि और phenotypes के साथ माउस उपभेदों 3 रखा जाता है, और इसलिए हम एक कांच में रूपांतर ते अनुकूलितchnique जिसके साथ हम चूहों के कई अलग अलग उपभेदों से भ्रूण cryopreserve vitrifying और परिवेश के तापमान पर 4 विगलन (या liquefying, और अधिक ठीक) के बाद उच्च भ्रूण अस्तित्व के लाभ के साथ कर सकते हैं.
यहाँ, हम माउस भ्रूण कि सफलतापूर्वक किया गया है हमारे केंद्र पर इस्तेमाल के लिए एक कांच में रूपांतर विधि उपस्थित थे. cryopreservation समाधान ethylene DMSO के बजाय glycol 5 भ्रूण विषाक्तता कम से कम होता है . यह भी Ficoll और विकांचीकरण और आसमाटिक समायोजन की रोकथाम के लिए sucrose क्रमशः होते हैं,. भ्रूण कमरे के तापमान पर संभाला जा सकता है और 5 मिनट के भीतर तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित. क्योंकि मूल विधि प्लास्टिक कंटेनर के रूप में तिनके के लिए अनुकूलित किया गया था, हम थोड़ा cryotubes है, जो अधिक आसानी से सुलभ और प्रयोगशालाओं में अधिक शारीरिक नुकसान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. हम भी विस्तार में vitrified भ्रूण विगलन की प्रक्रिया का वर्णन है क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण Ste के हैजीवित चूहों के कुशल वसूली के लिए पी. ये तरीके शोधकर्ताओं और तकनीशियनों, जो बाद में उपयोग के लिए माउस उपभेदों के संरक्षण की जरूरत है एक सुरक्षित और लागत प्रभावी ढंग में मददगार होगा.
Rall और Fahy द्वारा माउस भ्रूण के कांच में रूपांतर के पहले दो 1985 में रिपोर्ट के बाद से, कई तकनीकी सुधार विगलन के बाद भ्रूण के survivability बढ़ाने के लिए बनाया गया है. सबसे सफल संशोधनों के ethylene glycol के उपयोग की वजह से अपनी कम विषाक्तता और उच्च झिल्ली पारगम्यता cryoprotectant के रूप में हासिल की थी. इस तरह के लाभ हमें कमरे के तापमान पर 4 ठंड भ्रूण को संभालने के लिए सक्षम, अन्य कांच में रूपांतर तरीकों कूलर तापमान में सौंपने भ्रूण की आवश्यकता होती है और हमेशा BALB / 6 ग सहित चूहों के कुछ उपभेदों के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. पहली ethylene glycol आधारित कांच में रूपांतर Kasai एट अल द्वारा विकसित किया गया था. 5,7 १,९९० में. क्योंकि मूल विधि प्लास्टिक कंटेनर के रूप में तिनके के लिए अनुकूलित किया गया था, हम थोड़ा cryotubes है, जो अधिक आसानी से सुलभ और प्रयोगशालाओं में अधिक शारीरिक नुकसान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया है. इसलिए, कांच में रूपांतर विधि यहाँ वर्णित app हो सकता हैकई अनुसंधान मॉडल के रूप में चूहों का उपयोग प्रयोगशालाओं को licable. एक ही विधि भी morula और ब्लास्टोसिस्ट चरणों 8 और चूहे 9 भ्रूण माउस भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हम हाल ही में पाया है कि cryotubes की गुणवत्ता ठंड के विगलन के बाद भ्रूण के जीवित रहने की दरों को प्रभावित कर सकता है. इस प्रकार, यह आवश्यक है vitrifying भ्रूण (जैसे, विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की टेबल पर देखें) से पहले अपनी चिकनाई के लिए cryotubes के अंदर सतह की जांच करने के लिए.
कांच में रूपांतर तरीकों पारंपरिक धीमी ठंड तरीकों पर कई फायदे हैं, लेकिन वे स्वाभाविक परिवहन के उद्देश्य के संबंध में एक नुकसान है. Vitrified भ्रूण के रूप में -120 नीचे रखा जाना चाहिए सी उनकी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए °, सूखी shippers आम तौर पर अपने सुरक्षित परिवहन के लिए उपयोग किया जाता है. ड्राई shippers और भारी भारी रहे हैं, और उनके राउंड ट्रिप महंगा अंतरराष्ट्रीय ढुलाई के लिए विशेष रूप से है. अब हम वर्तमान में कर रहे हैं के द्वारा एक नई कांच में रूपांतर विधि विकसितजो vitrified भ्रूण सूखी बर्फ के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है (-80 ° सी के बारे में) के कम से कम 7 10 दिनों के लिए. इस विधि अगली पीढ़ी के कांच में रूपांतर किया जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
यह अध्ययन राष्ट्रीय BioResource परियोजना के साथ सहयोग में आयोजित किया गया, शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान, प्रौद्योगिकी और, जापान.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Bovine serum albumin | Merck Biosciences (Calbiochem) | 12657 | |
Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries | 058-00986 | |
Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 041-00595 | |
NaCl | Wako Pure Chemical Industries | 191-01665 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries | 169-04245 | |
Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries | 500-04195 | |
MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries | 031-00435 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | |
M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Cryotube | Sumitomo Bakelite | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |