Concentratie van de metabolieten van Low-density Planktonische Gemeenschappen voor het milieu Metabolomics met behulp van nucleaire magnetische resonantie spectroscopie
Summary
Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.
Abstract
Milieu-metabolomics is een opkomend gebied dat nieuwe inzicht is het bevorderen van de manier waarop organismen reageren op en interageren met de omgeving en elkaar op de biochemische niveau 1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is een van de verschillende technologieën, zoals gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), met veel belofte voor dergelijke studies. Voordelen van NMR is dat het geschikt is voor ongerichte analyses, biedt structurele informatie en spectra kunnen worden opgevraagd in kwantitatieve en statistische manieren tegen de laatst beschikbare databases van individuele metaboliet spectra 2,3. Daarnaast kunnen NMR spectrale data worden gecombineerd met gegevens uit andere omics niveaus (bijv. transcriptomics, genomics) om een meer omvattend begrip van de fysiologische reacties van taxa op elkaar en het milieu 4,5,6 te geven. Echter, NMR is minder gevoelig dan andere metaboloom technieken, waardoor het moeilijk is aplagen aan de natuurlijke microbiële systemen waar steekproefpopulaties kan een lage dichtheid en metaboliet concentraties laag in vergelijking met metabolieten van goed gedefinieerde en gemakkelijk winbare bronnen zoals hele weefsels, biovloeistoffen of cel-culturen. Bijgevolg hebben de weinige directe milieu metabolietvorming van microben tot nu toe uitgevoerde beperkt tot cultuur-gebaseerd of gemakkelijk te definiëren met hoge dichtheid ecosystemen zoals host-symbiont systemen, gebouwd co-culturen of manipulaties van de darm omgeving waar stabiele isotopen de etikettering kunnen worden tevens worden gebruikt ter verbetering NMR signalen 7,8,9,10,11,12. Methoden dat de concentratie en verzamelen van het milieu metabolieten vergemakkelijken concentraties voor NMR ontbreken. Sinds de recente aandacht is besteed aan de milieu-metabolomics van organismen in het aquatisch milieu, waar veel van de energie-en materiaalstroom wordt gemedieerd door de planktonische gemeenschap 13,14, hebben we een methode ontwikkeld voor de concentratieTIE en extractie van hele gemeenschap metabolieten van planktonische microbiële systemen door middel van filtratie. Handel verkrijgbare hydrofiele poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filters speciaal behandeld voor het verwijderen extraheerbare, die anders kunnen als verontreinigingen in de daaropvolgende analyse. Deze behandelde filters worden vervolgens gebruikt om milieu-of experimentele monsters van belang te filteren. Filters met de natte monstermateriaal gevriesdroogd en waterige oplosbare metabolieten direct geëxtraheerd voor conventionele NMR spectroscopie een gestandaardiseerde kaliumfosfaatbuffer extractiebuffer 2. De gegevens zijn afgeleid van deze methoden kan worden geanalyseerd statistisch betekenisvolle patronen te identificeren, of geïntegreerd met andere omics niveaus voor uitgebreide kennis van de gemeenschap en ecosysteem functie.
Protocol
Discussion
De filtratie en metaboliet extractiemethode aangetoond hier zorgt voor microbiële plankton biomassa kan worden geïnd in voldoende hoeveelheid voor NMR metabolomics. Terwijl slechts extractie van water-oplosbare metabolieten met behulp van KPI en 1D 1 H NMR is aangetoond, kunnen andere extractiemiddelen en spectroscopische methoden worden gebruikt. Een goed voorbeeld is het gebruik van gedeutereerde methanol als semi-polair oplosmiddel, dat is aangetoond dat superieure NMR spectra produceren van heterogene m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede ondersteund door subsidies-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek voor de aanhouding van verkennend onderzoek (JK), en Wetenschappelijk Onderzoek (A) (JK en SM) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan . Een RIKEN FPR fellowship (RCE), mits extra ondersteuning. De auteurs uiten hun dankbaarheid aan Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama en Mami Okamoto voor technische bijstand met behulp van NMR en statistische analyses.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
