ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה
Summary
שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.
Abstract
Metabolomics הסביבה היא תחום המתפתח כי הוא מקדם הבנה חדשה כיצד אורגניזמים להגיב ולתקשר עם הסביבה ועל זה ברמה הביוכימית 1. ספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית (NMR) תהודה היא אחת מספר טכנולוגיות, כולל כרומטוגרפיה המוני גז ספקטרומטריית (GC-MS), עם הבטחה רבה מחקרים כאלה. היתרונות של התמ"ג הם כי הוא מתאים ניתוחים לא ממוקדים, מספק מידע מבניים ספקטרה ניתן שאילתה באופנים כמותיים וסטטיסטיים מול מסדי נתונים זמינים לאחרונה של ספקטרום המטבוליט הפרט 2,3. בנוסף, נתוני תמ"ג ספקטרליות ניתן לשלב עם נתונים אחרים (רמות omics transcriptomics למשל הגנומיקה) כדי לספק הבנה מקיפה יותר של התגובות הפיזיולוגיות של מינים זה לזה ולסביבה 4,5,6. עם זאת, התמ"ג הוא רגיש פחות טכניקות metabolomic אחרים, ולכן קשה APרובדי חיידקים למערכות הטבעיות שבה אוכלוסיות המדגם ניתן בריכוזים נמוכים, צפיפות המטבוליט נמוכה בהשוואה מטבוליטים של מוגדרים היטב ובנפש חפצה מקורות שניתן להפיק כגון רקמות, biofluids שלמים או תאים תרבויות. כתוצאה מכך, המחקרים המעטים ישיר metabolomic הסביבתיות של חיידקים שבוצעו עד כה היה מוגבל צפיפות גבוהה מערכות אקולוגיות התרבות מבוססות או להגדיר בקלות כמו מארח הסימביונט מערכות, שנבנו שיתוף תרבויות או מניפולציות של הסביבה שבה המעיים תיוג איזוטופ יציב יכול להיות בנוסף משמש כדי לשפר את אותות תמ"ג 7,8,9,10,11,12. שיטות להקל על ריכוז ואיסוף של מטבוליטים סביבתיים בריכוזים מתאימים NMR חסרים. מאז תשומת לב לאחרונה ניתנה על metabolomics הסביבתיות של אורגניזמים בתוך הסביבה המימית, שם הרבה זרימת האנרגיה והחומר מתווך על ידי הקהילה planktonic 13,14, פיתחנו שיטה הריכוזtion והפקת כולו הקהילה מטבוליטים של מערכות חיידקים planktonic על ידי סינון. זמינים מסחרית הידרופילי פולי-1 ,1-difluoroethene (PVDF) מסננים מטופלים במיוחד כדי להסיר לחלוטין extractables, אשר יכול אחרת המופיעים מזהמים ניתוחים שלאחר מכן. מסננים אלה שטופלו משמשות לאחר מכן כדי לסנן דגימות סביבתיות או ניסיוני של עניין. מסננים המכילים את החומר מדגם רטוב הם lyophilized ו מימית מסיסים מטבוליטים מופקים ישירות ספקטרוסקופית NMR קונבנציונאלי באמצעות אשלגן זרחתי מיצוי מתוקנן חיץ 2. הנתונים המופקים בשיטות אלו ניתן לנתח סטטיסטית לזהות תבניות בעלות משמעות, או משולב עם רמות omics אחרים הבנה מקיפה של הקהילה ותפקוד המערכת האקולוגית.
Protocol
Discussion
שיטת סינון המטבוליט החילוץ הפגינו כאן מאפשר ביומסה planktonic חיידקים כדי לאסוף כמות מספקת metabolomics תמ"ג. תוך מיצוי רק מימית מסיסים מטבוליטים באמצעות KPI ו 1D 1 H NMR באה לידי ביטוי, מיצוי בממסים אחרים וגישות ספקטרוסקופיות ניתן להשתמש. דוגמה שימושית הוא השימוש מתנול deutera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים, סיוע, למחקר מדעי על מאתגר מחקר גישוש (JK), ומחקר מדעי (A) (ג'יי קיי ו SM) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן . FPR RIKEN המילגה (RCE) מספקת תמיכה נוספת. המחברים מביעים את תודתם בני הזוג. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama ו מאמי אוקמוטו לקבלת סיוע טכני עם NMR וניתוחים סטטיסטיים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
