Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare
Summary
Un metodo per l'estrazione metabolita da parte delle comunità microbiche planctonici è presentato. Campionamento intera comunità si realizza mediante filtrazione su filtri appositamente preparati. Dopo liofilizzazione, acquoso-solubili metaboliti vengono estratti. Questo approccio consente per l'applicazione della metabolomica ambientali trans-omiche indagini di comunità microbiche naturali o sperimentali.
Abstract
Metabolomica ambientale è un settore emergente che sta promuovendo una nuova comprensione in come gli organismi rispondere e interagire con l'ambiente e l'altro a livello biochimico 1. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una delle varie tecnologie, compreso il gas cromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), con la promessa di un notevole per tali studi. I vantaggi di NMR sono che è adatto per le analisi non mirati, fornisce informazioni strutturali e spettri può essere interrogato in maniere quantitativi e statistici nei confronti di banche dati disponibili di recente dei singoli spettri metabolita 2,3. Inoltre, i dati NMR spettrali possono essere combinati con dati provenienti da altri livelli omiche trascrittomica (ad esempio, la genomica), per fornire una comprensione più completa delle risposte fisiologiche di taxa gli uni agli altri e l'ambiente 4,5,6. Tuttavia, NMR è meno sensibile rispetto ad altre tecniche metabolomica, rendendo difficile apply ai sistemi microbici naturali dove campioni di popolazione possono essere le concentrazioni a bassa densità e basso rispetto al metabolita metaboliti ben definite e facilmente estraibili fonti, quali tessuti interi, biofluidi o cellulo-culture. Di conseguenza, i pochi studi ambientali diretti metabolomica di microbi eseguiti fino ad oggi sono stati limitati alla cultura-based o facilmente definito ad alta densità ecosistemi come host-simbionti sistemi, costruiti co-colture o manipolazioni dell'ambiente intestinale in cui l'etichettatura isotopi stabili possono essere inoltre utilizzati per migliorare segnali NMR 7,8,9,10,11,12. Metodi che facilitano la concentrazione e la raccolta dei metaboliti ambientali a concentrazioni adatte NMR mancano. Dal recente attenzione è stata data alle metabolomica ambientali degli organismi nell'ambiente acquatico, in cui è mediata gran parte del flusso di energia e materiali da parte della comunità planctoniche 13,14, abbiamo sviluppato un metodo per la concentrazionezione e l'estrazione di tutta la comunità-metaboliti microbici planctonici dai sistemi di filtrazione. Disponibili in commercio idrofile poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF), i filtri sono appositamente trattati per rimuovere completamente estraibili, che possono altrimenti apparire come contaminanti nelle analisi successive. Questi filtri trattati vengono poi usati per filtrare i campioni ambientali o sperimentale di interesse. Filtri contenenti il materiale umido campione sono liofilizzato e acquosa metaboliti solubili vengono estratti direttamente per la spettroscopia NMR convenzionale utilizzando un tampone fosfato di potassio standardizzato di estrazione 2. I dati derivano da questi metodi possono essere analizzati statisticamente per identificare i modelli significativi, o integrato con gli altri livelli omiche per la comprensione globale della comunità e il funzionamento dell'ecosistema.
Protocol
Discussion
L'estrazione filtrazione e metabolita metodo illustrato qui permette per la biomassa microbica planctoniche da raccogliere in quantità sufficiente per metabolomica NMR. Mentre solo di estrazione acquosa-solubili metaboliti utilizzando KPI e 1D 1 H NMR è dimostrata, altri solventi da estrazione e approcci spettroscopici possono essere utilizzati. Un esempio utile è l'uso di metanolo deuterato come solvente semi-polare, che ha dimostrato di produrre spettri NMR superiore da campioni eterogenei ed è …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Grants-in-Aid per la ricerca scientifica per contestare la ricerca esplorativa (JK), e della Ricerca Scientifica (A) (JK e SM) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone . Una borsa di studio RIKEN FPR (RCE) offerto un sostegno supplementare. Gli autori esprimono la loro gratitudine a Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto per l'assistenza tecnica con la NMR e analisi statistiche.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Referências
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
