Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em
Summary
Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.
Abstract
Peixe-zebra tornou-se um organismo modelo benéfico e prático para o estudo do desenvolvimento embrionário do coração (ver comentários recentes 1-6), no entanto, o trabalho de examinar pós-embrionário, através do desenvolvimento adulto cardíaca tem sido limitada 7-10. Examinar a morfologia mudança do coração amadurecimento e envelhecimento são restritas pela ausência de técnicas disponíveis para o estadiamento e isolar os corações juvenis e adultos. A fim de analisar o desenvolvimento do coração mais tempo de vida do peixe, dissecamos corações zebrafish em estágios numerosos e fotografá-los para posterior análise 11. As características morfológicas do coração podem ser facilmente quantificadas e corações individuais podem ser posteriormente analisado por uma série de métodos standard. Zebrafish crescer a taxas variáveis e maturação se correlaciona melhor com o tamanho do peixe do que a idade, assim, pós-fixação, nós comprimento dos peixes fotografia e medida como um indicador de maturação dos peixes. Este protocolo explica duas distintas, tamanho técnicas de dissecção dependente de peixe-zebra, que vão desde larvas de comprimento padrão de 3,5 mm (SL) com corações de comprimento ventrículo 100μm (VL), para adultos, com SL de 30mm e 1mm VL ou maior. Larvas de peixes e adultos têm corpo bastante distintos e morfologia do órgão. Larvas não são apenas significativamente menor, eles têm menos pigmentos e cada órgão é visualmente muito difíceis de identificar. Por este motivo, usamos técnicas de dissecção distintas.
Usamos pré-dissecção procedimentos de fixação, como descobrimos que os corações dissecados imediatamente após a eutanásia tem uma morfologia mais variável, com balão muito solto e, como átrios em comparação com os corações retirados fixação seguintes. O peixe fixadas antes dissecção, manter vivo na morfologia e posição de câmara (dados não mostrados). Além disso, para fins de demonstração, aproveitamos do coração (miocárdio) específicos GFP transgênicos Tg (myl7: GFP) twu34 (12), o que nos permite visualizar todo o coração e é particularmente útil nos primeiros estágios de desenvolvimento quando o cardíaco morfologia é menos distinta dos tecidos adjacentes. Dissecção do coração faz uma análise mais aprofundada da biologia celular e molecular subjacentes ao desenvolvimento e maturação do coração utilizando hibridização in situ, imuno-histoquímica, extração de RNA ou outros métodos de análise mais fácil no pós-embrionário zebrafish. Este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da maturação de desenvolvimento cardíacas e envelhecimento.
Protocol
Discussion
Estes métodos para dissecção do coração do peixe zebra pós-embrionário de peixes permite a remoção completa de um coração danificado. Embora essa técnica é simples e fornece guias para cortes externos que irão evitar danos ao coração, uma mão firme é essencial para peixes menores.
Um passo fundamental durante a dissecção é identificar o pericárdio prateado como o coração está diretamente dentro desse saco. Visualizando o pericárdio fornece um importante marcador par…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Graças à Marie Birne, Tsiola Areti, Estevez Jaymie e Uribe Arelys. Este trabalho foi financiado em parte pela CUNY Research Foundation e Instituto Médico Howard Hughes Grant Programa de Verão para Estudantes de Graduação (SPUR) e RO3 NIH 41702-00-01. A pesquisa foi apoiada também por Queens College e alguns dos experimentos foram feitos em equipamentos a partir do Núcleo Facility for Imaging, Biologia Celular e Molecular no Queens College.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
Referências
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