Guldmyntfoten för DNA-metylering analys är genomisk sekvensering av, dock omvandlas DNA. Denna metod tar fördel av den ökade känslighet cytosin jämfört med 5-methylcytosine (5-MEC) till, dock deaminering under sura förhållanden. Unmethylated cytosines kan skiljas från metylerad cytosines efter PCR-amplifiering av målet arvsmassans DNA.
Epigenetik beskriver ärftliga förändringar i genen funktion som inträffar oberoende av varandra till den DNA-sekvens. Den molekylära grunden för epigenetisk genreglering är komplex, men i grunden handlar om modifieringar av DNA i sig eller de proteiner som DNA medarbetare. Den dominerande epigenetisk modifiering av DNA i genomer är metylering av cytosin nukleotider (5-MEC). DNA-metylering ger instruktion till genuttryck maskiner om var och när genen skall uttryckas. Den primära målsekvens för DNA-metylering i däggdjur är 5'-CpG-3 "dinucleotides (figur 1). CpG dinucleotides är inte jämnt fördelade över hela genomet, men är koncentrerad till regioner av upprepade genomiska sekvenser och CpG "öar" som vanligen förknippas med gen projektansvariga (Figur 1). DNA-metylering mönster etableras tidigt i utvecklingen, modulerade under vävnad specifika differentiering och störs i många sjukdomstillstånd inklusive cancer. För att understand den biologiska roll DNA-metylering och dess roll i mänskliga sjukdomar, exakt, effektiv och reproducerbara metoder krävs för att detektera och kvantifiera individuella 5-mecs.
Detta protokoll för, dock omvandling är den "gyllene standarden" för DNA-metylering analys och underlättar identifiering och kvantifiering av DNA-metylering vid enstaka nukleotid upplösning. Kemi cytosin deaminering av natriumbisulfit omfattar tre steg (figur 2). (1) sulfonering: Tillägget av, dock till 5-6 dubbelbindningen av cytosin (2) Hydrolic deaminering: hydrolytisk deaminering av den resulterande cytosin-, dock derivat för att ge en uracil-, dock derivat (3) Alkali Desulphonation: Borttagning av långkedjiga grupp genom en alkali, att ge uracil. , Dock deaminates företrädesvis cytosin till uracil i enstaka DNA, medan 5-Mec är refraktära mot, dock-medierad deaminering. Efter PCR-amplifiering är uracil förstärkssom tymin, medan 5-Mec rester kvar som cytosines, så metylerade CpGs ska skiljas från unmethylated CpGs genom närvaron av en cytosin "C" kontra tymin "T" rest under sekvensering.
DNA-modifiering av, dock omvandlingen är ett väletablerat protokoll som kan utnyttjas för många metoder för DNA-metylering analys. Sedan upptäckten av 5-Mec med, dock omvandlingen först bevisas av Frommer et al. 1 och Clark et al. 2, metoder baserade runt, dock omvandlingen av arvsmassans DNA står för merparten av nya uppgifter om DNA-metylering. Olika metoder av post PCR-analys kan användas, beroende på graden av specificitet och lösning av metylering krävs. Kloning och sekvensering är fortfarande den mest lättillgängliga metod som kan ge enda nukleotid upplösning för metylering i DNA-molekylen.
DNA-metylering analys av genomisk sekvensering av, dock omvandlas DNA är en väletablerad och mångsidig metod som underlättar identifiering och kvantifiering av DNA-metylering vid enstaka nukleotid upplösning. Baseras dock, dock konvertering och efterföljande analys på förutsättningen att DNA helt har omvandlats med varje unmethylated cytosin är deaminerade till uracil och bara metylerat cytosines kvar un-reaktivt. Om konvertering är ofullständig, kan problem uppstå med analysen eftersom oomvända unmethylated cytosines kan felaktigt tolkas som denaturerad cytosines. , Dock konvertering kan optimeras i olika skeden för att maximera andelen konvertering. För DNA för att vara helt omvandlas det först måste enkelsträngad så att cytosin rester utsätts för, dock joner. Det första steget, DNA denaturering, är kritisk och kan vara en källa till ofullständig omvandling om DNA är inte helt denaturerad. För att säkerställaatt DNA är fullständigt denaturerad är det viktigt att reaktionen parametrar, bland annat borttagande av alla tillhörande protein, lämplig salthalt, inkubation temperatur och tid är lämpliga för att upprätthålla DNA i enkelsträngad konformation. Det är viktigt att använda färska 3M NaOH och att adekvat inkubationstid. Om DNA är motstånd denaturering kan vissa ändringar av protokollet, inklusive att förlänga inkubationstiden till 30 minuter eller fragmentera DNA innan denaturering underlätta DNA denaturering. Dessutom kan enstaka DNA (ssDNA) åter glödga till dubbelsträngat DNA (dsDNA) under, dock konverteringen reaktion. Genomförande av reaktionen vid en högre temperatur (90-95 ° C) antingen regelbundet eller kontinuerligt under, dock reaktionen kan hjälpa underhåll av ssDNA. Det är dock viktigt att vara medveten om att DNA-nedbrytningen är kraftigt snabbare vid dessa högre temperaturer. Olika reagenser kan också läggas att störa nytt glödgning av the DNA-strängar, som urea.
Koncentrationen av DNA och dess kvalitet kan också påverka effektivitet, dock reaktionen och slutliga PCR avkastning. DNA nedbrytning är en begränsning av det, dock omvandlingen protokollet. Den kemiska behandlingen av DNA introducerar olika strängbrott i ssDNA och några av de hårda villkor som krävs för fullständig, dock omvandlingen inklusive hög, dock koncentration, långa inkubationstiderna kan påskynda DNA nedbrytning. Enligt standarden beskrivna reaktionen förhållanden, är DNA nedbrytning inte är ett vanligt problem men om protokoll ändringar införs, till exempel för sekvenser som är terapiresistenta konvertering, för DNA-mallar som bryts ned eller av dålig kvalitet som FFPE prover, sedan DNA-degradering kan bli en betydande begränsning.
Formalin fast, paraffininbäddade (FFPE) och nedbrutna prover DNA kan på ett effektivt sätt, dock omvandlas och förstärks med hjälp av detta protokollMen förändringar för att säkerställa att DNA är inte vidare försämras rekommenderas. Användningen av en transportör RNA som t RNA rekommenderas. Också glykogen kan läggas till som en bärare när DNA-koncentrationen är låg (<200 ng). Eftersom DNA isolerat från FFPE vävnader är redan splittrad och ytterligare fragmentering sker under deaminering måste försiktighet vidtas för att minimera ytterligare nedbrytning. Inte splittrar DNA ytterligare innan denaturering och begränsa inkubationstiden för, dock reaktionen på 4 timmar. Design amplicons inte större än 300 BP på grund av fragmenterad DNA.
En annan faktor som kan påverka PCR-amplifiering att, dock omvandlingen av unmethylated cytosines reducerar komplexiteten i DNA-mallen. Följande primer design protokoll som beskrivs i avsnitt 4.1, ökad primer längd och nästlade PCR kan alla bidra till att öka specificitet och PCR avkastning.
Slutligen är då DNA-mallen ändras under bisulphite konvertering, förstärkning bias kan vara ett bekymmer. Se till att proportionellt PCR-amplifiering av metylerade och unmethylated mallar är markerad med en kontroll 50/50 M / U DNA-mix, som beskrivs i protokollet, se figur 3. Se också till att förstärkningen av bara konverterade mallar sker med hjälp av HpaIII restriktionsenzymanalys och gelelektrofores (Figur 3). PCR förhållanden kan behöva optimeras genom att variera temperatur och / eller magnesium koncentration eller förlänga förlängning tid. Vissa mallar verkar vara särskilt problematiskt och primer ställning kan behöva justeras eller degenererade primers kan behöva användas.
Nästa generations sekvensering tekniker utvecklas snabbt för att uppnå en liknande resolution till, dock genomiska sekvensering, och tredje generationen enda molekyl sekvensering har potential att möjliggöra analyser av både primär DNA och metylering utan behov av, dock sekvensering. Men omfattande tillgänglighet och specificity av dessa tekniker återstår en tid bort. , Dock genomisk sekvensering är den högsta standarden inom metylering analys och är en robust protokoll. Metoden har utvecklats till den punkt där de gemensamma problem och begränsningar har lösts och ansökningarna har expanderat från enskilda gen analyser för hög genomströmning och hela genomet analys beskrivs av Clark et al. 2006 4. Felsökning riktlinjer och ytterligare rekommendationer som beskrivs i tabell 1. Det föreslås att den optimala strategin är att inledningsvis följa standardprotokoll och endast införa ändringen, om och när ett problem uppstår.
Tabell 1. Felsökning Riktlinjer
The authors have nothing to disclose.