कट लोड हो रहा है: रेटिना न्यूरॉन्स के बीच गैप जंक्शन अनुरेखक युग्मन की सीमा की जांच के लिए एक उपयोगी टूल

Summary

रेटिना न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की सीमा निर्धारित करने के लिए एक आसान और सुविधाजनक विधि वर्णित है. इस तकनीक को एक अलग रोशनी की शर्तों के तहत और दिन और रात के अलग अलग समय पर बरकरार रेटिना में न्यूरॉन्स के बीच बिजली के synapses के समारोह की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent^1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.

Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions^3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling^3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation^7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.

Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading^9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas^{7, 8,13}, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

Protocol

1. सुनहरीमछली चूहों और खरगोशों के लिए बरकरार तंत्रिका रेटिना की तैयारी लगातार परिवेश रोशनी (पृष्ठभूमि) के तहत निम्न चरणों के सभी में वर्णित उन सहित, "") 2 कट लोडिंग प्रदर्शन करना. कृपया ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, प्रक्रियाओं के रूप में प्रदर्शन लगातार अंधेरे में वर्णित हैं (यानी बहुत अंधेरा (यानी "Scotopic") शर्तों के तहत ≤ लक्स 0.0001) रात दृष्टि अवरक्त चश्मे का उपयोग, लेकिन अन्य उच्च लगातार परिवेश रोशनी की तीव्रता के स्तर बजाय प्रयोग किया जा अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन पर परिवेश की रोशनी के अन्य स्तरों के प्रभाव को निर्धारित कर सकते हैं. डार्क अनुकूल सर्जरी से पहले कम से कम 1 घंटा के लिए प्रयोगात्मक पशु (सुनहरीमछली माउस, या खरगोश). के रूप में 7 पहले से वर्णित है, गहरी उन्हें tricaine methanesulfonate (MS222, 150 बफर (सोडियम बिकारबोनिट युक्त) मछली टैंक पानी की मिलीग्राम / एल) में रखकर सुनहरीमछली anesthetize, और गहरी ketamine (100 मिलीग्राम के साथ चूहों anesthetize/ किलो, आईपी) और rompun (10 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी). गहरा urethane के साथ खरगोश (लोड हो रहा खुराक: 2.0 ग्राम / किलो, आईपी) anesthetize और भी स्थानीय intraorbital संज्ञाहरण (2% Xylocaine) का उपयोग करें, के रूप में 8 पहले से वर्णित है. सभी प्रयोगात्मक और पशुओं की देखभाल का उपयोग शामिल प्रक्रियाओं संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए और समीक्षा की और स्थानीय विश्वविद्यालय जानवरों की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित है. (नोट: प्रयोगों में यहाँ वर्णित है, सभी प्रयोगात्मक और मछली की देखभाल का उपयोग शामिल प्रक्रियाओं, चूहों और खरगोशों एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और समीक्षा थे और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित) मछली, चूहों और खरगोशों के लिए, निम्नलिखित स्पष्टीकरण, तो प्रत्येक नेत्रगोलक की पूर्वकाल भाग को हटा दें. फिर, आंखों के पीछे भाग के शीर्ष पर फिल्टर कागज का एक टुकड़ा जगह और फिल्टर पेपर और आंख पलटना, ताकि फिल्टर पेपर आंख के पीछे भाग के नीचे है. फिर, ठीक का उपयोगसंदंश आंख के पीछे भाग से धीरे दूर वर्णक उपकला / / रंजित श्वेतपटल, जो एक दूसरे से जुड़ी तंत्रिका रेटिना, जो फिल्टर पेपर से जुड़ा हुआ है से छीलने के द्वारा बरकरार तंत्रिका रेटिना टुकड़े करना. के रूप में इस किया है, ऑप्टिक तंत्रिका ठीक वसंत लोड कैंची का उपयोग कर काट दिया. तंत्रिका रेटिना, उन्मुख फोटोरिसेप्टर साइड अप, अब फिल्टर पेपर के लिए संलग्न किया जाना चाहिए और आंख के बाकी से अलग है. 2. कट – लोडिंग डूब oxygenated है घंटी समाधान (1 टेबल) में लगातार परिवेश (पृष्ठभूमि) के साथ रोशनी (जैसे बहुत अंधेरा शर्तों (यानी "Scotopic") के तहत) के तहत 30 मिनट के लिए एक थाली 6 अच्छी तरह से (~ 5 एमएल अच्छी तरह /) में या बिना retinas एक परीक्षण दवा. Parafilm साथ थाली 6 अच्छी तरह सील कर oxygenated में मछली retinas (5% सीओ 2 / 95% 2 हे) बिकारबोनिट – आधारित घंटी 22 ° C बनाए रखने और 36 ° C पर एक 5% सीओ में बनाए रखने के माउस और खरगोश retinas 2 / 95% हे <suख> 2 इनक्यूबेटर. जब एक परीक्षण दवा प्रयोग किया जाता है, यह निर्धारण जब तक सभी बाद के चरणों के दौरान उपस्थित होना चाहिए रेटिना के माध्यम से काटने से पहले तुरंत घंटी समाधान में neurobiotin (0.5%), एक biotinylated अणु, भंग द्वारा ट्रेसर समाधान (आमतौर पर 100 μL) तैयार करें. नोट करें कि 0.5% rhodamine dextran (उच्च (> दस हज़ार) मेगावाट) समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है है. अपने उच्च आण्विक भार के कारण, rhodamine dextran अंतराल जंक्शनों और केवल लेबल कोशिकाओं है कि कटौती के द्वारा क्षतिग्रस्त किया गया पार नहीं करता है. जैसा छवि में दिखाया गया है. 3, यह कोशिकाओं है कि neurobiotin संचित है, क्योंकि वे घायल हो गया है, उन है कि अंतराल जंक्शनों के माध्यम से प्रसार द्वारा ट्रेसर संचित है से भेद करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. (या प्लास्टिक) कांच पेट्री डिश पर neurobiotin समाधान रखें, एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त घंटी निकालने के लिए, neurobiotin समाधान में डुबकी एक रेजर ब्लेड (या अन्य तेज ब्लेड) और फिल्टर पेपर, जो रेटिना संलग्न है नलn रेटिना और फिल्टर पेपर के माध्यम से एक रेडियल काट कर. पसंदीदा यदि, spacers इतना इस्तेमाल किया जा सकता है कि रेटिना के माध्यम से कटौती किया जाता है, लेकिन फिल्टर कागज नहीं है. कटौती को सीधा रेटिना सतह उन्मुख होना चाहिए. Neurobiotin समाधान में रेजर ब्लेड डुबकी और फिर रेटिना एक दूसरे समय में कटौती. रेटिना (चित्र देखें 1.) प्रति 4 में कटौती करने के लिए इस दोहराएँ. जब माउस और अन्य छोटे retinas के माध्यम से उस्तरा कटौती करने विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. जैसा छवि में दिखाया गया है. 1, फिर से ताजा घंटी मध्यम में रेटिना के साथ या परीक्षण दवा के बिना, डूब, एक अच्छी तरह से 6 प्लेट (5 एमएल घंटी / अच्छी तरह से) का उपयोग. 15 मिनट के लिए रेटिना सेते लोड हो रहा है और प्रसार के लिए अनुमति देते हैं. 5 मिनट प्रत्येक के साथ ताजा घंटी मध्यम के साथ या दवा के बिना परीक्षण के लिए तीन बार धोएं. आरटी पर 1 घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबीएस, पीएच 7.4) में 4% paraformaldehyde के साथ रेटिना को ठीक करें. 0.1 एम पीबीएस के साथ 4 पर रातोंरात धो डिग्री सेल्सियस अगले दिन प्रतिक्रिया, with 2% streptavidin 488 – Alexa (अंतिम 10 एकाग्रता / μg एमएल) 0.1M पीबीएस में + 0.3% ट्राइटन X-100, और 4 में रात भर रखने डिग्री सेल्सियस 10 मिनट प्रत्येक आरटी पर 0.1M पीबीएस के साथ के लिए तीन बार धो पीबीएस में, फिल्टर पेपर से रेटिना अलग और तब ठीक एक ब्रश का उपयोग करने के लिए, किसी स्लाइड पर रेटिना, उन्मुख अप फोटोरिसेप्टर साइड जगह है. धीरे Vectashield बढ़ते मध्यम (वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame, CA) के साथ माउंट. एक ही बढ़ाई, और हर प्रयोगात्मक हालत के लिए संकल्प सेटिंग्स पर स्कैनिंग लेजर confocal सूक्ष्मदर्शी (जैसे Zeiss मेटा 510) के साथ तस्वीरें ले लो, ताकि आप विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के (जैसे परीक्षण दवाओं, रोशनी शर्तों) के प्रभाव की तुलना कर सकते हैं की सीमा पर अंतराल के संगम ट्रेसर युग्मन (छवि 2A सी और अंजीर. 4A – सी). हालांकि एक एकल छवि लेबल की कोशिकाओं के सभी शामिल कर सकते हैं, यह अनुशंसित है कि आप हित के क्षेत्र के z-ढेर इकट्ठा करने और इसे एक एकल में पतनछवि. 3. ट्रेसर युग्मन की मात्रा का ठहराव ImageJ का उपयोग LSM छवि ब्राउज़र में, छवि खोलते हैं, निर्यात करें क्लिक करें और एक TIF 16-संपीड़ित फ़ाइल नहीं बिट के रूप में चित्र को बचाने. स्केल बार इस TIF छवि में शामिल किया जाना चाहिए. एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग, पूरे माउंट retinas के कम बढ़ाई छवियों से Alexa – 488 लेबल neurobiotin प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. TIF फ़ाइल खोलें ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर और फिर एक सीधे पैमाने पट्टी करने के लिए इसी रेखा खींचना. विश्लेषण करने के लिए जाओ, पैमाने पर सेट और ज्ञात दूरी और लंबाई की इकाई दर्ज करें, तो ठीक क्लिक करें. अब माप परिणाम ऐसे मिलीमीटर के रूप में में कैलिब्रेटेड इकाइयों में प्रस्तुत किया जा सकता है है. आयताकार चयन उपकरण का उपयोग कर हित के क्षेत्र का चयन करें. प्रतिदीप्ति के शिखर अपने चयन के बाईं सीमा पर तैनात किया जाना चाहिए. सुनिश्चित करें कि वहाँ सही सीमा के पास कोई प्रतिदीप्ति संकेत है. यदि नहीं, तो सक्रिय छवि (इमेज, तब घूम) को घुमाएगी. क्लिक करेंविश्लेषण और शख्सियत साजिश. आप बाएँ से सही करने के लिए एक घातीय क्षय के साथ एक वक्र देखना चाहिए. पॉप – अप विंडो में प्रतिलिपि बनाएँ क्लिक करें और इसे Excel में चिपकाएँ. अब आप दो (बाएँ स्तंभ) दूरी के एक समारोह के रूप में कटौती और प्रतिदीप्ति तीव्रता कटौती से (सही कॉलम) से दूरी दिखा स्तंभों देखते हैं. रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त अधिकतम प्रतिदीप्ति मान द्वारा प्रत्येक कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्य फूट डालो. कॉपी दो कटौती (एक्स) और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता (वाई) से दूरी के लिए इसी, और तब कॉलम उन्हें उत्पत्ति सॉफ्टवेयर में पेस्ट करें. घातीय क्षय # 1 (छवि 2D और अंजीर 4D) समारोह है, जो फार्म में है के साथ फ़िट: वाई = 0 वाई + Y अधिकतम ऍक्स्प * (x-λ /) वाई अधिकतम, वाई ओ, जहां Y रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है अधिकतम रिश्तेदार प्रतिदीप्ति है, λ सपाइक्का (लंबाई) निरंतर, और x कटौती से दूरी है. टी – परीक्षण या एनोवा (छवि 2E और अंजीर. 4E) का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों पर अंतरिक्ष से निरंतर मूल्यों (λ) की तुलना करें. ध्यान दें कि मात्रा का ठहराव के वैकल्पिक तकनीक 13,14 दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है . 4. प्रतिनिधि परिणाम फोटोरिसेप्टर सेल युग्मन के रूप में कटौती लोड हो रहा है द्वारा निर्धारित ट्रेसर के प्रतिनिधि उदाहरण 2 आंकड़े और 3 (मछली) और चित्रा 4 (खरगोश) में प्रस्तुत कर रहे हैं. Confocal छवियों तुलना (छवि 2A सी और अंजीर. 4A-सी) और प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर ले जाया गया था कटौती से दूरी के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते हैं और घातीय समारोह के ऊपर सं 3.8 में दिखाया गया है द्वारा फिट (छवि 2 डी और चित्र 4D). हर हालत के लिए अंतरिक्ष निरंतर मूल्यों2E और 4E आंकड़े में दिखाया गया है, illustrating है कि अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक कटौती लोड हो रहा तकनीक का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है . इसके अलावा, परिणाम अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक बढ़ाता का एक साधन के के रूप में कटौती लोड हो रहा तकनीक का प्रयोग भी लग रहा है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता सभी मामलों में कटौती से दूरी के एक समारोह के रूप में तेजी से घट जाती है द्वारा मान्य है 7,8 जांच (भी अंजीर देख. 2 डी और 4D यहाँ), यह दर्शाता है कि neurobiotin उस्तरा और अन्य रेटिनल साइटों से कटौती नहीं के माध्यम से photoreceptors में प्रवेश किया. इसके अलावा, गुणात्मक इसी तरह फोटोरिसेप्टर सेल ट्रेसर युग्मन में फर्क दिन / रात ट्रेसर इंजेक्शन के साथ एक शंकु में सुनहरीमछली में और 7 कटौती लोडिंग के साथ मनाया फोटोरिसेप्टर युग्मन की हद तक को मापने का एक अपेक्षाकृत सटीक साधन के रूप में कटौती लोड हो रहा है substantiates. कट loading तकनीक भी रेटिना में विद्युत synapses के अन्य प्रकार की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, चित्रा 5 कि खरगोश एक प्रकार (छवि 5A) और (छवि 5B) बी प्रकार क्षैतिज कोशिकाओं मुताबिक़ प्रदर्शन ट्रेसर युग्मन दिखाता निम्नलिखित कटौती लोड हो रहा है और काले अनुकूलित की शर्तों के तहत neurobiotin के प्रसार. यौगिक मछली माउस खरगोश NaCl 130 120 117 3 NaHCO 20 25 30 नाह 4 पीओ 2 – 1 0.5 KCL 2.5 5 3.1 ग्लूकोज 10 10 10 2 MgCl 1 – – MgSO 4-7 2 हे – 1 1.2 Glutamine – 0.1 0.1 2 CaCl 0.7 2 2 तालिका 1: सुनहरीमछली, माउस, और खरगोश retinas के लिए घंटी के समाधान की संरचना. सांद्रता मिमी में प्रस्तुत कर रहे हैं. घंटी समाधान 5% सीओ 2 / 95% 2 हे के साथ bubbled कर रहे हैं और 22 डिग्री सेल्सियस (मछली) या 36 डिग्री सेल्सियस (स्तनधारी) पर रखा. "-" इस प्रजाति के लिए घंटी में शामिल नहीं है. चित्रा 1: फ्लो चार्ट कटौती लोडिंग प्रक्रिया दिखा. अलगाव ओ के बादच बरकरार तंत्रिका रेटिना, कई रेडियल कटौती द्वारा किए गए एक ब्लेड है कि पहले 0.5% neurobiotin समाधान में डूबा हुआ था. रेटिना ट्रेसर लोड हो रहा है और प्रसार के लिए incubated किया गया था, और फिर 0.1M फॉस्फेट बफर (पंजाब) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ नियतन से पहले धोया. अनुरेखक युग्मन Alexa 488 streptavidin-संयुग्मित का उपयोग कर जांच की गई थी. चित्रा 2. सुनहरीमछली में दिन – रात फोटोरिसेप्टर ट्रेसर युग्मन में अंतर कटौती लोडिंग तकनीक से पता चला है. फोटोरिसेप्टर सेल अंतराल जंक्शन neurobiotin ट्रेसर युग्मन (बी) रात और दिन में व्यापक spiperone (10 सुक्ष्ममापी), एक चयनात्मक डोपामाइन डी 2 रिसेप्टर प्रतिपक्षी (सी) के आवेदन के बाद, लेकिन नियंत्रण शर्तों (ए) के तहत दिन में नहीं. डी) सामान्यीकृत कटौती (एसी में तीर द्वारा संकेत) से दूरी के एक समारोह के रूप में रिश्तेदार फ्लोरोसेंट तीव्रता. ई) अंतरिक्ष निरंतर वैलडी और अन्य प्रयोगों (n = 4) में से डेटा प्राप्त ues. पी *** 0.001 <. चित्रा 3. रात में एक अंधेरे अनुकूलित सुनहरीमछली रेटिना फोटोरिसेप्टर सेल परत दोनों neurobiotin और rhodamine dextran के एक समाधान के साथ कटौती लोड हो रहा है निम्नलिखित में एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखा प्रतिदीप्ति . Rhodamine dextran (लाल रंग में दिखाया गया है), जो खुले अंतराल जंक्शन इसकी उच्च आणविक वजन (> 10,000 मेगावाट), कट के पास ही लेबल कोशिकाओं के कारण चैनलों के माध्यम से फैलाना नहीं करता है. इसके विपरीत, (हरे रंग में दिखाया गया है) neurobiotin अंतराल जंक्शनों के माध्यम से विसरित और अब तक की कटौती से फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में देखा जा सकता है है. कटौती का स्थान प्रत्येक पैनल में तीर द्वारा संकेत दिया है. स्केल पट्टी: 200 सुक्ष्ममापी. चित्रा 4 अलग दिन – रात.फोटोरिसेप्टर ट्रेसर में खिलाडि़यों खरगोश रेटिना में युग्मन कटौती लोडिंग तकनीक से पता चला है. फोटोरिसेप्टर सेल अंतराल जंक्शन neurobiotin ट्रेसर युग्मन (बी) रात और दिन में व्यापक spiperone (10 सुक्ष्ममापी) (सी) के आवेदन के बाद, लेकिन नियंत्रण शर्तों (ए) के तहत दिन में नहीं. एसी में कटौती के पास खरगोश photoreceptors के 3D पुनर्निर्माण का सीधा दृश्य दिखाए जाते हैं. डी) सामान्यीकृत कटौती से दूरी के एक समारोह के रूप में रिश्तेदार फ्लोरोसेंट तीव्रता. ई) अंतरिक्ष निरंतर मान डी और अन्य प्रयोगों (n = 3) में डेटा से प्राप्त की. पी *** 0.001 <. चित्रा 5 कट – लोडिंग से पता चलता है कि काले अनुकूलित खरगोश क्षैतिज कोशिकाओं ट्रेसर मिलकर कर रहे हैं. दोनों (एक) एक प्रकार के और बी प्रकार (बी) काले अनुकूलित खरगोश retinas में क्षैतिज कोशिकाओं मुताबिक़ neurobiotin ट्रेसर युग्मन का प्रदर्शन किया.

Discussion

कटौती लोड हो रहा है यहाँ वर्णित विधि अलग रोशनी की शर्तों के तहत और दिन और रात के अलग अलग समय पर रेटिना न्यूरॉन्स के बीच की खाई जंक्शन ट्रेसर युग्मन की सीमा निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी और सरल तकनीक है. इस तकनीक का लाभ रोशनी शर्तों की एक किस्म के तहत दिन और रात के दौरान बरकरार रेटिना ऊतक में न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक और यों मिलकर न्यूरॉन्स है कि छोटे व्यास somata के लिए ऐसा करना करने की क्षमता शामिल हैं. दो सामान्य श्रेणियों में बरकरार ऊतक गिरावट में अंतर जंक्शनों के अध्ययन में तकनीक की सीमाएं. पहला, खुला अंतराल जंक्शनों के माध्यम से ट्रेसर प्रसार अपेक्षाकृत मुश्किल हो) के छोटे व्यास या खुला चैनल और ख) युग्मित सेलुलर डिब्बों के रिश्तेदार मात्रा ^1,14,15 के साथ जुड़े प्रभारी के कारण निरीक्षण कर सकते हैं. यही कारण है, एक छोटे सेल से एक बड़ा कक्ष या मिलकर कोशिकाओं के समूह, COMP करने के लिए प्रसार ट्रेसरट्रेसर एक बड़ा कक्ष से एक छोटे सेल प्रसार ared, और अधिक मुश्किल हो ट्रेसर कमजोर पड़ने के कारण का पता लगाने सकता है. दूसरा, कुछ शारीरिक शर्तों के तहत, ट्रेसर प्रसार के माध्यम से बरकरार ऊतक में अंतर जंक्शनों की हद तक सही अंतराल junctional प्रवाहकत्त्व की ताकत छोटे से बिजली के वर्तमान ले जाने के आयनों के प्रवाहकत्त्व में मतभेद के कारण अपेक्षाकृत बड़े दरियाफ्त की पारगम्यता की तुलना में प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है ^1,14,15 अणुओं. सामान्य में, ट्रेसर युग्मन के सबूत जोरदार कामकाज, खुला अंतराल जंक्शन चैनलों की मौजूदगी से पता चलता है, लेकिन कुछ शारीरिक शर्तों के तहत, ट्रेसर प्रसार हो या नहीं हो मनाया भले ही electrophysiological रिकॉर्डिंग कामकाज, खुला अंतराल जंक्शनों की उपस्थिति का सुझाव कर सकते हैं.

यह संभावना लगता है कि कटौती लोड हो रहा है कि तकनीक भी बरकरार ऊतकों में केंद्रीय तंत्रिका व्यवस्था के अन्य क्षेत्रों से न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमंदिर.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Tricaine methane sulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040	150 mg/L of buffered fish tank water
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	2 g/kgloading dose
Dual Tube Night Vision Goggle	Night Optics USA	D-221
Filter Paper, Grade No. 4	Whatman	1004-090
Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long	Fine Science Tools	11295-10
Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight	Fine Science Tools	15025-10
Neurobiotin	Vector	SP-1120	0.5%
Streptavidin-conjugated Alexa 488	Invitrogen	S11223	2%
Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW)	Invitrogen	D1817	0.5%
Vectashield mounting medium	Vector	H-1000
Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115	Carl Zeiss, Inc.
ImageJ Software	NIH
OriginPro 8.0	OriginLab Corp.