En enkel og praktisk metode for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller er beskrevet. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke funksjonen av elektriske synapser mellom nevroner i intakt netthinnen under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten.
I tillegg til kjemiske synaptisk overføring, kan nevroner som er koblet sammen med gap veikryss også kommunisere raskt via elektriske synaptisk overføring. Økende bevis indikerer at gap veikryss ikke bare tillater elektrisk strøm og synkrone aktivitet mellom sammenkoblede eller sammen celler, men at styrken eller effektiviteten av elektrisk kommunikasjon mellom kombinert celler kan moduleres i stor grad 1,2. I tillegg tillater den store indre diameter (~ 1,2 nm) av mange gap junction kanaler ikke bare elektrisk strøm, men også spredningen av intracellulære signalmolekyler og små metabolitter mellom sammenkoblede celler, slik at gapet veikryss kan også megle metabolske og kjemiske kommunikasjon . Styrken i gapet junctional kommunikasjon mellom nevroner og dens modulering av nevrotransmittere og andre faktorer kan studeres ved å samtidig elektrisk opptak fra kombinert celler og ved å bestemme than omfanget av spredningen av sporstoff molekyler, som er gap junction gjennomtrengelig, men ikke membran gjennomtrengelig, etter iontophoretic injeksjon i enkeltceller. Imidlertid kan disse prosedyrene være svært vanskelig å utføre på nervecellene med små somata i intakt nevrale vev.
Tallrike studier på elektriske synapser og modulering av elektrisk kommunikasjon har vært gjennomført i virveldyr netthinnen, siden hver av de fem retinal nervecellen typer er elektrisk koblet med gap veikryss 3,4. Økende bevis har vist at circadian (24-timers) klokke i netthinnen og endringer i lys stimulering regulere gap junction kopling 3-8. For eksempel har nyere arbeid vist at retinal biologiske klokke minsker gap junction kopling mellom stang og kjegle fotoreseptoren celler i løpet av dagen ved å øke dopamin D2 receptor aktivering, og dramatisk øker rod-kjegle kopling om natten ved å redusere D2 receptor aktivering <sup> 7,8. Men ikke bare er disse studiene ekstremt vanskelig å utføre på nervecellene med små somata i intakt nevrale retinal vev, men det kan være vanskelig å tilstrekkelig kontrollere belysningen forholdene under elektrofysiologiske studier av single netthinnens nerveceller for å unngå lys-indusert forandringer i gap junction ledningsevne.
Her presenterer vi en enkel metode for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten. Dette cut-lasting teknikken er en modifikasjon av skrape lasting 9-12, som er basert på fargestoff lasting og diffusjon gjennom åpne gap junction kanaler. Skrap lasting fungerer godt i dyrkede celler, men ikke i tykke skiver som intakt netthinne. Cut-lasting teknikken har blitt brukt til å studere fotoreseptoren kobling i intakt fisk og pattedyr 7 netthinne, 8,13, og kan brukes til å studere kobling mellomandre retinal nevroner, som beskrevet her.
Cut-lasting metoden som beskrives her er et nyttig og grei teknikk for å fastslå omfanget av gap junction tracer kopling mellom netthinnens nerveceller under forskjellige lys forhold og til forskjellige tider av dagen og natten. Fordeler med denne teknikken inkluderer muligheten til å kvantifisere omfanget av gap junction tracer kopling mellom nevroner i intakt retinal vevet under en rekke belysning forholdene i løpet av dagen og natten og til å gjøre det for kombinert nevroner som har liten diameter somata. Begrensninger av teknikken i studiet av gap veikryss i intakt vev faller i to generelle kategorier. Først kan tracer diffusjon gjennom åpne gap veikryss være relativt vanskelig å observere på grunn av a) den lille diameteren eller belaste forbundet med åpne kanaler og b) den relative mengder kombinert cellene 1,14,15. Det vil si, tracer diffusjon fra en liten celle til en større celle eller gruppe av sammen celler, compared til tracer diffusjon fra en større celle til en mindre celle, kan være vanskeligere å oppdage på grunn av tracer fortynning. Second, under visse fysiologiske forhold kan omfanget av tracer diffusjon gjennom gap veikryss i intakt vev ikke nøyaktig gjenspeile styrken av gapet junctional konduktans grunn av forskjeller i ledningsevne av små elektrisk strømførende ioner, i forhold til permeabilitet av relativt store tracer molekyler 1,14,15. Generelt tyder bevis på sporstoff kopling sterkt nærvær av funksjon, åpne gap junction-kanaler, men under visse fysiologiske forhold, kan tracer diffusjon ikke oppstå eller bli observert selv om elektrofysiologiske opptak tyder på tilstedeværelsen av fungerende, åpent gap veikryss.
Det virker sannsynlig at cut-lasting teknikken kan også brukes til å undersøke omfanget av gap junction tracer kopling mellom nevroner i intakt vev fra andre regioner av sentralnervesystemet system.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd EY005102 til SCM og EY018640 til HLR
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
ImageJ Software | NIH | ||
OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |