यहाँ हम CD133 स्टेम व्यक्त जिगर और पूरे murine जिगर, एक प्रक्रिया है कि ऊतक पाचन, सेल, संवर्धन और प्रवाह cytometry अलगाव की आवश्यकता से कोशिकाओं को कैंसर स्टेम कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन. हम उन्नत एक सेल अलगाव और clonal विस्तार के लिए तरीके शामिल हैं.
लिवर स्टेम सेल, या अंडाकार कोशिकाओं, जीर्ण जिगर की चोट के दौरान पैदा कर रहे हैं, और दोनों hepatocytes और cholangiocytes में अंतर करने का प्रस्ताव है. इसके अलावा, जिगर स्टेम कोशिकाओं यकृत कैंसर, hepatocellular कार्सिनोमा के एक सबसेट के लिए व्यापारियों की धारणा कर रहे हैं. प्राथमिक जिगर की तरह किसी भी ठोस अंग में स्टेम सेल काम करने की चुनौतियों की कोशिकाओं के एक दुर्लभ आबादी के विस्तृत विश्लेषण के लिए अलग है. उदाहरण के लिए, जिगर में कोशिकाओं के विशाल बहुमत hepatocytes (parenchymal अंश), जो गैर parenchymal कोशिकाओं की तुलना में काफी बड़े होते हैं. जिगर की विशिष्ट सेलुलर डिब्बों (यानी parenchymal और गैर parenchymal fractions) को समृद्ध और CD45 नकारात्मक कोशिकाओं के लिए चयन करके, हम 600-fold.The स्टेम सेल के शुरू जनसंख्या के लिए अनुमति देने के इस रिपोर्ट में proceduresdetailed को समृद्ध करने में सक्षम हैं एक ठोस अंग से कोशिकाओं के एक अपेक्षाकृत दुर्लभ जनसंख्या कुशलतापूर्वक हल. इस प्रक्रिया isolateli करने के लिए उपयोग किया जा सकता हैदेखें सामान्य murine जिगर से स्टेम कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीर्ण जिगर चोट मॉडल है, जो वृद्धि हुई जिगर स्टेम सेल प्रसार का प्रदर्शन. इस पद्धति जमी या formalin निश्चित जिगर के मानक immunohistochemistry पर स्पष्ट लाभ के रूप में कार्य जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अध्ययन के प्रारंभिक सह स्थानीयकरण प्रयोगों के बाद किया जा सकता है. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, एक शोध आधारित मूल प्रवाह cytometry के साथ एक काम कर रिश्ता दृढ़ता से FACS अलगाव के विवरण के रूप में विशेष उपकरण और बुनियादी प्रवाह cytometry प्रक्रियाओं के एक मजबूत कार्यसाधक ज्ञान पर अत्यधिक निर्भर हैं प्रोत्साहित किया जाता है. इस प्रक्रिया के विशिष्ट लक्ष्य जिगर स्टेम कोशिकाओं कि clonally इन विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है की एक आबादी को अलग करने के लिए है.
Hematopoietic प्रणाली के विपरीत है, जो hematopoietic स्टेम सेल एक सेलुलर भेदभाव की प्रणाली को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं कि replacesnormal शारीरिक बारी पर leukocytes, लाल रक्त कोशिकाओं, और प्लेटलेट्स, जिगर स्टेम सेल, या वयस्क जिगर पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के सामान्य जिगर में नहीं भाग ले सकता हूं homeostasis. 5,6 विभेदित जिगर उपकला के रूप में तीव्र जिगर चोट या आंशिक hepatectomy, hepatocytes, के बाद प्रसार के कई दौर से गुजरना खो जिगर जन की जगह पुरानी चोट के दौरान. 5,6 केवल जिगर स्टेम कोशिकाओं मनाया पैदा करना. 1,5 -11 ये वयस्क, अंग विशेष स्टेम कोशिकाओं प्रस्तावित कर रहे हैं दोनों hepatocytes और cholangiocytes में अंतर 1,5-8 दिलचस्प है, यकृत कैंसर के विशाल बहुमत पुरानी चोट की पृष्ठभूमि पर विकसित है, और इस प्रकार जिगर स्टेम कोशिकाओं को भी हो धारणा जिगर के कैंसर का एक सबसेट के लिए व्यापारियों 2-4,12-17.
हेप्रमुख जिगर में स्टेम सेल काम करने की चुनौतियों के पूर्वोत्तर कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कक्षों की दुर्लभ आबादी के अलगाव है. उदाहरण के लिए, जिगर में कोशिकाओं के विशाल बहुमत hepatocytes, जो काफी cholangiocytes और अन्य छोटे गैर parenchymal कोशिकाओं की तुलना में बड़े होते हैं. सेल (parenchymal अंश और छोटी कोशिकाओं – बड़े hepatocytes गैर parenchymal अंश) डिब्बों में पूरे जिगर तोड़ने, और आगे CD45 नकारात्मक कोशिकाओं (गैर hematopoietic कोशिकाओं) के लिए चयन, हम करने के लिए स्टेम सेल के शुरू जनसंख्या को समृद्ध करने में सक्षम हैं 600 गुना से अधिक 1,18-21 ध्यान से, हम कोई संकेत है कि CD133 + जनसंख्या एक 100% शुद्ध स्टेम सेल की आबादी है, लेकिन स्पष्ट रूप से अलग वंश और repopulation क्षमता के साथ कोशिकाओं के एक विषम आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, के माध्यम से कर रहे हैं. क्षेत्र की प्रमुख सीमाओं की स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की परिभाषा है. हम शब्द "स्टेम सेल" अधिक मोटे तौर पर इस काम में उपयोग करते हैं, लेकिन सख्त परिभाषा में CD133 + गैर parenchymal कोशिकाओं को एक द्वि – वंश पूर्वज आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं. वर्तमान और जिगर में पूर्वज अनुसंधान स्टेम की स्थिति को देखते हुए, इस रिपोर्ट जांचकर्ताओं जो इस क्षेत्र में रुचि रखते हैं के लिए एक प्रारंभिक जगह प्रदान करता है. के रूप में नए मार्करों EpCAM, 22,23 या Sox9 के रूप में प्रतिलेखन कारकों, 24 के रूप में उभरने, वे शामिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम EpCAM + कोशिकाओं और CD133 + कोशिकाओं के बीच एक ओवरलैप का काफी उच्च दर पाया है.
इस रिपोर्ट में, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य murine जिगर जीर्ण जिगर चोट मॉडल है, जो जिगर स्टेम सेल प्रसार बढ़ दिखाना है से स्टेम सेल अलगाव के लिए हम एक प्रक्रिया विस्तार. इस पद्धति जमी या formalin निश्चित जिगर के मानक immunohistochemistry पर स्पष्ट लाभ के रूप में कार्य जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अध्ययन के अलगाव के बाद किया जा सकता है 1,3,4 इस प्रक्रिया के विशिष्ट लक्ष्य जिगर स्टेम सेल कि कर सकते हैं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी अलग जा clonally इन विट्रो में विस्तार किया गया है.
<p cलड़की = "jove_content"> इस प्रक्रिया के लिए प्राथमिक सीमा यह है कि अलग कक्षों के बहुमत प्रवाह cytometry के बाद आर्थिक रूप से व्यावहारिक नहीं हो (मुसीबत शूटिंग अनुभाग देखें). यह कोशिकाओं को तैयार करने की आवश्यकता घंटे का परिणाम है, और कई प्रक्रियाओं अलगाव के पहले आबादी को परिष्कृत करने के लिए आवश्यक है. यदि जिगर तत्काल FACS विश्लेषण के लिए एकल कक्ष निलंबन में पच जाता है, hepatocytes और अन्य गैर parenchymal कोशिकाओं के बीच आकार अंतर प्रभावी FACS गेट निर्माण असंभव कर देगा. यदि गैर parenchymal जिगर कोशिकाओं, hematopoietic कोशिकाओं के उन्मूलन के बिना उपयोग किया जाता है, वहाँ एक जोखिम है कि CD133 + कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या hematopoietic मूल के अंश दूषित हो सकता है. इसके अलावा, प्रसंस्करण Miltenyi फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा, केवल एकल कक्षों और कोशिकाओं के बहुत छोटे समूहों एकत्र कर रहे हैं. यह सुनिश्चित करता है कि नमूना FACS सेवन सुई नहीं रोकना होगा.इस प्रक्रिया के लिए विकल्प मीटर शामिलकिसी भी वैकल्पिक ऐसे CD49f, EpCAM के रूप में सेल सतह मार्कर, या इस तरह के रूप में मार्कर के संयोजन के लिए odification CD133 + EpCAM + एक दूसरे प्रकाशित रिपोर्ट एक घनत्व ढाल का इस्तेमाल करने के लिए एक गैर parenchymal अंश से जिगर स्टेम कोशिकाओं को अलग. यह प्रक्रिया एक अपकेंद्रित्र अल्ट्रा (8000 XG) की आवश्यकता है, प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण समय कहते हैं, और हमारे अनुभव में, काफी पूर्व FACS सेलुलर और उपज के बाद FACS व्यवहार्यता कम 8.
भविष्य प्रयोगों जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की एक व्यापक रेंज सहित भ्रूण जिगर ऐसे HNF3, HNF4α के रूप में जीन और αfp.In इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और व्यक्त प्रोटीन की immunocytochemistry संस्कृति में कोशिकाओं की RT-पीसीआर परिणामों की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, शामिल हैं.
एक नोट को मुद्दा हाल ही में काम यकृत तारामय कोशिकाओं पर CD133 अभिव्यक्ति की पहचान 25 अब हम नियमित तारामय कोशिकाओं के मार्कर (मुसीबत शूटिंग अनुभाग देखें) के लिए हमारे नमूने स्क्रीन, और आईडी नहीं हैहमारे भागों में महत्वपूर्ण संदूषण entified. यह जिगर पाचन और सेल अलगाव की विभिन्न तकनीकों 2,3,26 से संबंधित हो सकता है
तथ्य यह है कि कोशिकाओं के बहुमत FACS अलगाव के तुरंत बाद व्यवहार्य नहीं होगा पर आधारित है, हम अनुशंसा करते हैं कि कोशिकाओं चढ़ाया हुआ हो, या तो थोक CD133 + कोशिकाओं या एकल कक्षों के रूप में, पूर्व पशुओं में उपयोग. इन विट्रो में 5-7 दिनों में काफी ट्यूमर के विश्लेषण के परिणामों में सुधार होगा. इसके अलावा, एकल कोशिका अलगाव की कठोरता दिया, यह केवल एक बार कालोनियों थोक CD133 अलग कक्षों से विस्तारित किया जा सकता है आयोजित किया जाना चाहिए. विभिन्न संस्कृति शर्तों और पाड़ प्रोटीन है जो संस्कृति जिगर स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है की एक और अधिक गहन चर्चा अच्छी तरह से किया गया है लोला रीड द्वारा विशेषता है. यह काम वैकल्पिक शर्तों और संशोधनों प्रदान करता है, जो जांचकर्ताओं उनके अनुसंधान कार्यक्रम में शामिल एक बार बुनियादी अलगाव तकनीक में महारत हासिल कर रहे हैं हो सकता है 27,28 डॉ.. रीड worकश्मीर भी वंश और यकृत स्टेम कोशिकाओं और प्रतिबद्ध progenitors के बीच जीव विज्ञान परिपक्वता के एक अधिक विस्तृत विश्लेषण प्रदान करता है.
Vivo ट्यूमर विश्लेषण में संदर्भ में, हम सफलता मिली है clonally का विस्तार CD133 + कोशिकाओं से हौसले से अलग कोशिकाओं और कोशिकाओं का उपयोग करते हुए इन विट्रो में, मुख्य रूप से 1×10 6 कोशिकाओं का उपयोग. / – और जिगर विशिष्ट Pten / हम जीर्ण जिगर की चोट के ontwo आनुवंशिक उपभेदों MAT1a ध्यान केंद्रित किया है, चूहों और हम दोनों नग्न चूहों और ट्यूमर के विकास के लिए मेजबान के रूप में जंगली प्रकार चूहों का उपयोग किया है. हमारे अनुभव में, केवल CD133 + जिगर स्टेम कोशिकाओं ट्यूमर फार्म अगर वे महत्वपूर्ण जिगर चोट मॉडल है कि पूर्व घातक हैं से अलग कर रहे हैं. 2-4,29 कि CD133 से गठित ट्यूमर + कोशिकाओं सामान्य दोनों hepatocellular कार्सिनोमा और cholangiocarcinoma सुविधाओं, ट्यूमर के लिए एक स्टेम सेल या पूर्वज सेल मूल का सुझाव दे.
ट्यूमर के बाद काम अनुवर्ती inclu प्रलेखित रहे हैंdes मानक ट्यूमर ऊतक के वैकृत विश्लेषण (धुंधला हो जाना और एच ई) और immunohistochemical धुंधला हो जाना. इसके अलावा, ट्यूमर और कीमा बनाया हुआ जा सकता है FACS विश्लेषण या फिर संस्कृति के लिए पचा 2-4,30.
अंत में, हम अलगाव, विस्तार, + CD133 जिगर स्टेम कोशिकाओं और CD133 + कैंसर स्टेम कोशिकाओं की और बुनियादी लक्षण वर्णन के लिए एक प्रक्रिया का विस्तृत है.
मुसीबत शूटिंग:
CD45 संदूषण:
चरण 3 के लिए, अगर वहाँ CD45 + कोशिकाओं, जो एक CD45 FITC अब FACS विश्लेषण और अलगाव पहले जोड़कर मूल्यांकन किया जा सकता है के संदूषण है, जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि CD45 microbead एंटीबॉडी नहीं की समय सीमा समाप्त हो रहा है और छानना एकत्र किया गया था कि केवल जबकि फिल्टर चुंबकीय धारक में था. कोई छानना एकत्र चुंबकीय धारक CD45 + कोशिकाओं शामिल होंगे जबकि फिल्टर में नहीं है.
कम सेल नंबर:
रिहाई का जिगर, कुल numbeCD133 + r पृथक गैर parenchymal 10,000 से कम हो सकता है. ये कोशिकाओं मौन जिगर में दुर्लभ हैं. डीडीसी 0.1% आहार के रूप में एक पुरानी चोट मॉडल, के लिए, संख्या 100,000 कोशिकाओं को काफी वृद्धि होगी. यदि कुल सेल नंबर इन संख्या काफी नीचे है, एक मुद्दे पर विचार करने के लिए FACS अब धुंधला हो जाना है. जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि CD133 अब समाप्त नहीं हुई है, के रूप में गरीब धुंधला हो जाना एक गरीब उपज में परिणाम देगा. इसके अलावा, हम जिगर गैर parenchymal कोशिकाओं FACS विश्लेषण प्रदर्शन FACS अलगाव के लिए प्रयास करने के लिए रिश्तेदार आबादी पहले से निर्धारित करने की सलाह देते हैं.
FACS के बाद कम सेल व्यवहार्यता:
व्यवहार्यता के मुद्दों में से एक कैसे कोशिकाओं संसाधित कर रहे हैं से संबंधित हो सकता है और क्या समय से अधिक. आदर्श रूप में, पूरे सेल अलगाव प्रक्रिया, 1-4 कदम, कदम के बीच किसी भी देरी के बिना आयोजित किया जाना चाहिए और एक ही दिन में पूरा किया. 1-4 चरणों के बीच कोई महत्वपूर्ण देरी बहुत सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा. 2 ग के लिए संबंधित मुद्देपक्ष व्यवहार्यता म्यान FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल किया दबाव से संबंधित हो सकता है. हम एक कम म्यान दबाव का उपयोग करने की सलाह देते हैं. अंत में, एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, वे तुरंत चढ़ाया हुआ हो सकता है, के रूप में छँटाई के बाद बर्फ पर किसी भी महत्वपूर्ण भंडारण भी व्यवहार्यता कम हो जाएगा चाहिए.
CD133 + parenchymal विजातिता गैर:
हाल की रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि यकृत तारामय कोशिकाओं भी CD133 अभिव्यक्ति हो सकता है और कुछ plasticity है कि 25 इसलिए, Albumin और Krt19, अतिरिक्त सत्यापन के साथ द्वि – शक्ति जीन की पुष्टि करने के अलावा तारामय कोशिकाओं के साथ जुड़े glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन जैसे जीन शामिल कर सकते हैं. मौन तारामय कोशिकाओं और अल्फा चिकनी पेशी actin और सक्रिय तारामय कोशिकाओं में desmin 3,4,26 इसके अलावा, CD133 + जनसंख्या एक व्यापक पूर्वज जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है. EpCAM के रूप में एक दूसरे मार्कर, के अलावा जनसंख्या को संशोधित करने में मदद कर सकते हैं, और सीमा विजातिता.
The authors have nothing to disclose.
डा. Rountree बच्चों के चमत्कार नेटवर्क, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, K08DK080928 और R03DK088013, और अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर अवार्ड, MGO 11,651 से मौजूदा समर्थन को स्वीकार करता है. डॉ. Rountree मानता है कि इस प्रक्रिया के शुरू में और विकसित किया गया था परिष्कृत, जबकि बाल वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम (NICHD का अनुदान पुरस्कार K12 – HD00850) द्वारा वित्त पोषित है.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
DMEM:F12 | Invitrogen | 10565-018 | With phenol red |
CD45 microbeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | |
Epidermal Growth Factor | Sigma | E4127 | |
DNase | Sigma | DN25 | 1 gram |
Collagenase D | Roche | 1088874 | |
Pronase | Roche | 0165921 | |
70 micron mesh strainer | Fisher | 352350 | |
Omniscript RT | Quaigen | 205111 | 50 reactions |
HotStarTaq | Quaigen | 203203 | |
Miltenyi LD column | Miltenyi | 130-042-901 | |
CD133-PE FACS Ab | eBioscience | 12-1331-82 | |
Laminin coated plates | BD | 354410 | 96 well |
Trypsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300-354 | 100 mL |
RNeasy Micro Kit | Quaigen | 74004 | 50 columns for 5×105 cells or less |
Pharm Lyse | BD | 555899 | 10X concentration |