Lectin आधारित और माउस भ्रूणीय motoneurons के अलगाव संस्कृति

Summary

रीढ़ की हड्डी से अलग माउस भ्रूणीय motoneurons का एक वैकल्पिक तरीका वर्णित है. विधि खाते में तथ्य यह है कि लेक्टिन को कम आत्मीयता तंत्रिका वृद्धि कारक रिसेप्टर p75NTR करने के लिए बाध्य कर सकते हैं लेता है. इस लेक्टिन आधारित preplating p75NTR के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ करने के लिए इसी तरह की शुद्धि की अनुमति देता है.

Abstract

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons¹. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract^2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)⁴. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75^NTR. The p75^NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75^NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons⁵. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells⁶. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75^NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75^NTR as well⁷. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75^NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75^NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75^NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

Protocol

विशेष अभिकर्मकों के लिए: टैब देखें. 1. सभी अन्य अभिकर्मकों सूचीबद्ध सेल संस्कृति ग्रेड गुणवत्ता में सिग्मा Aldrich से प्राप्त कर रहे हैं. 1. व्यंजन / coverslips के PORN-H/laminin कोटिंग 150 मिमी borate बफर पीएच 8.35 में 0.5 मिलीग्राम / एमएल पाली – डीएल-ओर्निथिन hydrobromide (पोर्न एच) के काम समाधान तैयार करें. 50 मिलीग्राम / पोर्न 1 मिलीलीटर borate बफर स्टॉक समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 100% इथेनॉल में ज्वलंत कांच coverslips जीवाणुरहित और उन्हें हवा शुष्क. कवर पर्याप्त समाधान पोर्न एच के साथ रात 4 बजे सतह ° सी. निष्फल पानी और हवा शुष्क coverslips के साथ अगले दिन में तीन बार धो लो. HBSS में 2.5 μg / मिलीलीटर laminin के काम समाधान को तैयार Aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है 4 में ° सी तुरंत का उपयोग करने से पहले पिघलना. कवर laminin समाधान के साथ पोर्न-एच लेपित coverslips की सतह और उन्हें कम से कम 2 घंटे के लिए उपयोग करें जब तक कमरे के तापमान पर सेते हैं. 2. शुद्धि थाली के lectin कोटिंग निष्फल पानी, 9.5 पीएच में 10 मिमी Tris के एक समाधान तैयार करें. 10 μg / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता लेक्टिन ((L9640 सिग्मा) HBSS में लेक्टिन पाउडर को हल) जोड़ें. कोट लेक्टिन समाधान के 8 मिलीलीटर के साथ 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान की सतह और इसे कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए सेते हैं. थाली HBSS और उपयोग करें जब तक HBSS में दुकान के साथ तीन बार धो लें. एक 30mm KCl, 0.8% (w / v) NaCl विध्रुवण समाधान तैयार है. और कमरे के तापमान (आर टी) पर निस्पंदन दुकान से जीवाणुरहित. 3. Motoneuron संस्कृति के माध्यम पिघलना घोड़े सीरम 4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस और 55 में निष्क्रिय ° 30 मिनट के लिए सी, 5 मिलीलीटर और दुकान में पर विभाज्य -20 ° सी. पिघलना विभाज्य सीधे पहले आरटी पर उपयोग. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliqouts में B27 पूरक स्टोर आरटी में B27 पूरक तुरंत पहले गला लें उपयोग करने से पहले. स्थिर और पिघलना चक्र से बचें. अशेष भाजक glutamax और 0.5 मिलीलीटर -20 डिग्री सेल्सियस पर और aliquots दुकान में यह 1:100 पर उपयोग करें. 10 μg / मिलीलीटर CNTF में 0.1% BSA के साथ निष्फल पानी के एक शेयर समाधान तैयार है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 2.5 मिलीलीटर घोड़े सीरम, 1 B27 पूरक और सीधे का उपयोग करने से पहले 0.5 मिलीलीटर glutamax मिलीलीटर के साथ 46 मिलीलीटर neurobasal मध्यम मिक्स. CNTF 10 एनजी / एमएल और मध्यम पूर्व गर्म माध्यम की अंतिम एकाग्रता के लिए 37 सी. सेंटीग्रेड में जोड़ें 4. स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन एक गर्भवती E12.5 माउस बलिदान और भ्रूण को ध्यान से हटायें. पूरी तरह से भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त आरटी HBSS जोड़ें. सिर और पूंछ निकालें और पीछे की ओर भ्रूण straddled अंगों के साथ जगह. एक संदंश के साथ भ्रूण फिक्स और अन्य संदंश के साथ बाहरी त्वचा को हटा दें. इसके तहत संदंश भेदी द्वारा रीढ़ की हड्डी निकालें और यह रीढ़ की हड्डी के दोनों पक्षों पर देखा जैसे आंदोलनों के साथ लिफ्ट. HBSS के साथ एक नया पकवान पृथक रीढ़ की हड्डी स्थानांतरण और पृष्ठीय पक्ष पर रीढ़ की हड्डी के मध्य चैनल खुला. रीढ़ की हड्डी के enclosing meninges को हटाने के द्वारा पृष्ठीय रूट ganglia निकालें. एक Eppendorf प्रतिक्रिया ट्यूब 1 मिलीलीटर बर्फ पर HBSS और दुकान के साथ भर में 6 लेक्टिन प्लेट प्रति भ्रूण जब तक तैयारी किया है की रीढ़ की हड्डी डोरियों के काठ भागों लीजिए. 5. Motoneurons के लेक्टिन आधारित शुद्धि द्वारा संवर्धन नोट: अगले कदम शुरू करने से पहले, यहाँ नवीनतम तैयार करने और मध्यम prewarm (चरण 3 देखें.) 100 मिलीलीटर HBSS -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान और पिघलना में 1 छ trypsin 4 ° सी. सुलझाने के द्वारा एक trypsin समाधान तैयार मिक्स 1g 98 मिलीलीटर HBSS और 2 1 एम HEPES पीएच 7.4 मिलीलीटर के साथ trypsin अवरोध करनेवाला, 1 मिलीलीटर aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए एक सेल संस्कृति हुड के लिए रीढ़ की हड्डी डोरियों के साथ ट्यूब स्थानांतरण और ध्यान से HBSS के 700 μl हटायें. 7.5 μl trypsin समाधान और ध्यान से inverting ट्यूब द्वारा मिश्रण जोड़ें. 37 में 8 मिनट के लिए trypsination प्रदर्शन डिग्री सेल्सियस 30 μl trypsin अवरोध करनेवाला जोड़ने के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और विंदुक ऊपर और नीचे (महीन चुर्ण बनाना) 1000 μl विंदुक टिप के साथ सावधानी से 10-15 बार है जब तक कोई और अधिक सेल समुच्चय दिखाई दे रहे हैं. एक 20-200 μl विंदुक और इसी टिप के साथ विचूर्णन दोहराएँ. HBSS भरा लेक्टिन थाली में सेल समाधान पिपेट और धीरे थाली rotating द्वारा कोशिकाओं को फैलाने. आरटी पर 60 मिनट के लिए एक कंपन से मुक्त सतह पर लेक्टिन प्लेट रखें. इसे कवर करने के लिए संक्रमण से बचने. HBSS बहुत धीरे से निकालें और प्लेट ध्यान से पूर्व गर्म HBSS के साथ 4 बार सेल टुकड़े और संलग्न / स्वाधीन नहीं कोशिकाओं को दूर धोने. पिछले धोने कदम के तुरंत बाद, प्लेट 500 μl विध्रुवण समाधान जोड़ने और इसे 1min के लिए सेते हैं. झटकों से लेक्टिन बाध्य कोशिकाओं की टुकड़ी को सुकर बनाना औरथाली दोहन. 2 मिलीलीटर संस्कृति पूर्व गर्म मध्यम और एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण के साथ थाली भरें. NEUBAUER गिनती चैम्बर के साथ सेल नंबर की गणना. सेल प्लेट laminin लेपित coverslips या प्लेटें एक उचित संख्या में आवेदन के आधार पर पर. 1 दिन और बाद में पुराने मध्यम के 50% से सावधान प्रतिस्थापन द्वारा हर दूसरे दिन पर एक मध्यम विनिमय प्रदर्शन करना. हमेशा पूर्व गर्म, हौसले से तैयार नई संस्कृति के माध्यम का उपयोग करें. 6. प्रतिनिधि परिणाम: भ्रूण motoneurons E12 में E14 के लिए माउस भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है है. काठ का रीढ़ की हड्डी की कुल सेल की आबादी का 2-3% motoneurons के होते हैं और के रूप में पृष्ठीय रूट ganglionic न्यूरॉन्स p75 हैं एनटीआर पॉजिटिव रूप में अच्छी तरह से, यह महत्वपूर्ण है preplating लेक्टिन आधारित प्रक्रिया शुरू करने से पहले इन कोशिकाओं से छुटकारा पाने के ( अवलोकन के लिए चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें). दूसरे, meninges दृढ़ता से विभाजित कोशिकाओं है कि रूप में अच्छी तरह से बाहर रखा जाना चाहिए, के रूप में वे preplating लेक्टिन आधारित प्रक्रिया (चित्रा 2 और चित्रा 3) द्वारा ठीक से हटाया नहीं जा सकता शामिल हैं. बदतर मामलों में, इन कोशिकाओं संस्कृति प्लेटों अधिक बढ़ना कर सकते हैं. चित्रा 3B और 3 डी में प्रतिनिधि चित्रों को भी प्रदर्शन किया गया है प्रक्रियाओं धोने के बाद कम सेल घनत्व के बारे में एक छाप दे (5.9 प्रोटोकॉल का कदम देखें). भ्रूण माउस motoneurons की संस्कृतियों आमतौर पर अप करने के लिए पांच या सात दिनों के लिए रखा जाता है. इस समय अवधि के दौरान कोशिकाओं को अपनी neurites एक अधिकतम लंबाई (चित्रा 4) के लिए स्थापित. Neurite लंबाई दृढ़ता से 8 प्लेटों पर सब्सट्रेट पर निर्भर करते हैं . ठेठ सब्सट्रेट laminin जो कवर पोर्न एच संस्कृति व्यंजन पर लेपित है है. Motoneurons भी दूसरे या कम परिभाषित substrates पर बाहर विकसित कर सकते हैं कोशिकी पानी 8 lysis द्वारा उत्पन्न matrices की तरह . Suboptimal कोटिंग, neurite लंबाई और विकास शंकु क्षेत्र के मामलों में कमी आई है और कोशिका मृत्यु आमतौर पर बढ़ जाती है. लौटाव समर्थन संस्कृति में भ्रूण माउस motoneurons के अस्तित्व के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. पौष्टिकता 6 समर्थन के बिना दिन सात 10% से 20% करने के लिए ड्रॉप पर शुरू मढ़वाया कोशिकाओं की जीवन रक्षा . मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic (BDNF) कारक और सिलिअरी neurotrophic कारक (CNTF) सबसे अधिक इस्तेमाल किया कारक हैं, लेकिन दूसरों के रूप में अच्छी तरह [लेकिमिया निरोधात्मक कारक (LIF), Cardiotrophin 1 (सीटी-1), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF अस्तित्व को बढ़ावा कर सकते हैं ), विकास फैक्टर 1 (IGF-1) 9] इंसुलिन की तरह. चित्रा 1. भ्रूण माउस motoneurons की तैयारी के लिए फ्लो योजना. योजनाबद्ध ड्राइंग और माउस भ्रूणीय motoneurons के अलगाव और संस्कृति के लिए विभिन्न कदम दिखाता है. Abbreviations: रीढ़ की हड्डी, HBSS: अनुसूचित जाति हैंक्स संतुलित नमक समाधान, MN: motoneuron. चित्रा 2 E12.5 माउस से रीढ़ की हड्डी की काठ भाग के अलगाव: E12.5 माउस भ्रूण. अगले कदम के लिए, सिर और पूंछ हटा रहे हैं और शरीर की स्थिति पृष्ठीय अप बी में रखा गया है: एक पृष्ठीय अप स्थिति में भ्रूण है. छोड़ दिया और रीढ़ की हड्डी के सही संदंश अपनी स्थिति में भ्रूण शरीर तय कर रहे हैं. एक संदंश के बाद त्वचा में कटौती और अन्य के लिए अपनी स्थिति में भ्रूण को ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है रीढ़ की हड्डी के नीचे कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है सी: E12.5 माउस भ्रूण से पृथक रीढ़ की हड्डी. रीढ़ की हड्डी (गर्भाशय ग्रीवा, वक्ष, काठ) के कुछ हिस्सों को संकेत कर रहे हैं. रीढ़ की हड्डी meninges द्वारा घिरा हुआ है और पृष्ठीय रूट ganglia का हिस्सा अभी भी उन्हें देते डी: रीढ़ की हड्डी longitudinally पृष्ठीय पक्ष पर काट रहा है इसे केंद्रीय नहर की ओर खोलने ई: ventral पक्ष पर meninges अब कर रहे हैं. चपटा रीढ़ की हड्डी से दूर ले जाया. नोट: जबकि दूर ले जाया, काठ का हिस्सा एक छोटे काट द्वारा चिह्नित है एफ: रीढ़ की हड्डी के केवल काठ का हिस्सा तो आगे की प्रक्रियाओं के लिए लिया जाता है . चित्रा 3 E12.5 माउस भ्रूण की काठ का रीढ़ की हड्डी से आइलेट पॉजिटिव कोशिकाओं के निर्धारण और अलगाव एक:. भ्रूण काठ का रीढ़ की हड्डी के भीतर सभी आइलेट-1 / 2 एंटीबॉडी motoneuron स्तंभों लेबल (लाल तीर) और Hoechst लेबल अनुभाग के भीतर नाभिक. क्रॉस एक E12.5 lumar रीढ़ की हड्डी की धारा. E12.5 माउस भ्रूण थे 6 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में विसर्जन-तय, खारा फॉस्फेट buffered के साथ 3 बार धोया और मानक प्रक्रियाओं के लिए अनुसार sucrose के साथ इलाज. 20 सुक्ष्ममापी की Cryosections cryostat के साथ ले जाया गया और वर्गों immunhistochemical धुंधला के लिए मानक 11 प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला गया . वर्गों के बर्तन बाद में सेल नाभिक के स्थानीयकरण के लिए Hoechst के साथ लेबल है. ध्यान दें किपृष्ठीय रूट ganglionic न्यूरॉन्स Islet-1/2-positive के रूप में अच्छी तरह से और कहा कि तैयार करने की प्रक्रिया अलगाव प्रक्रिया से इस ऊतक भागों शामिल नहीं बी: आइलेट-1 / लेबल 2 (लाल तीर) dissociated काठ E12 से रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं .. 5 भ्रूण, बाएँ – से पहले और सही – लेक्टिन आधारित preplating के बाद. कोशिकाओं Hoechst के साथ counterstained थे सभी सेल नाभिक कल्पना सी: Islet-1/2-positive कोशिकाओं के पहले और बाद लेक्टिन – आधारित preplating मात्रा डी: संस्कृति में एक दिन के बाद E12.5 भ्रूण से Nkx6.1 लेबल motoneurons .. कोशिकाओं Hoechst साथ counterstained थे सभी नाभिक cisualieze. ध्यान दें कि सभी कोशिकाओं के 90% Nkx6.1 सकारात्मक हैं. लघुरूप: MN, रीढ़ की हड्डी:: अ motoneuron; DRG: पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि. चित्रा 4 E12.5 माउस motoneurons के Characterisation ए और बी. समृद्ध E12.5 माउस काठ का रीढ़ की हड्डी में motoneurons 0 दिन (0div) इन विट्रो में और इन विट्रो (2div) में 2 दिन p75 एनटीआर व्यक्त पृथक. कक्ष 4% paraformaldehyde के साथ तय किया गया और बाद में मानक प्रक्रियाओं के लिए अनुसार p75 एनटीआर के लिए दाग. कक्ष Hoechst का उपयोग करने के लिए सभी नाभिक कल्पना counterstained सी: समृद्ध motoneurons पोर्न एच और laminin पर संस्कृति substrates के रूप में इन विट्रो (5div) में 5 दिनों के बाद और β-III-ट्यूबिलिन के लिए CNTF दाग की उपस्थिति में . नोट कि कोशिकाओं को बाहर लंबे neurites हो गए हैं और एक लंबे समय तक (branched) की प्रक्रिया और एक या एक से अधिक कम प्रक्रियाओं (axons और dendrites) के साथ ठेठ motoneuron आकारिकी प्रदर्शित. लघुरूप: MN: motoneuron; div: इन विट्रो में दिन. Lectin आधारित preplating बिना हदबंदी के बाद कोशिकाओं / अनुसूचित जाति की कुल संख्या Trypan नीले पॉजिटिव कोशिकाओं [%] Islet-1/2- सकारात्मक कोशिकाओं [%] 1 995.0 13,1 9,5 2 889.4 8,0 10,0 3 1.180.0 11,0 10,8 ± एसडी मीन 1.021.0 ± 147.1 10,7 ± 2,6 10,1 ± 0,7 लेक्टिन आधारित preplating के साथ बाद कोशिकाओं की संख्या preplating अनुसूचित जाति / Trypan नीले पॉजिटिव कोशिकाओं [%] Islet-1/2- सकारात्मक कोशिकाओं [%] 1 189.6 9,9 70,5 2 168.8 3,7 76,1 3 125.0 0,0 72,5 ± एसडी मीन 161.1 ± 33.0 4,5 ± 5,0 73,0 ± 2,8 तालिका 1. विशेष रूप से इस प्रयोजन के लिए 3 अलग अलगाव प्रक्रियाओं से E12.5 मंच से माउस भ्रूण motoneurons के लिए प्रतिनिधि अलगाव प्रक्रियाओं के सारांश परिणाम कुल संख्या या प्रतिशत संख्या ± एसडी के रूप में दिया जाता है. संक्षिप्त: रीढ़ की हड्डी, एसडी:: एससी मानक विचलन. P75 panning [%] के साथ आइलेट – 1 / 2 सकारात्मक कोशिकाओं Lectin आधारित [%] panning के साथ / आइलेट 1 2 सकारात्मक कोशिकाओं 92,0 ± एक 3,5 73,0 ± 2,8 तालिका 2. Lectin आधारित और p75 आधारित एक panning motoneuron सेल नंबर की तुलना परिणाम प्रतिशत ± संख्या एसडी के रूप में दिया जाता है.

Discussion

इस preplating लेक्टिन आधारित तकनीक का लाभ यह है कि यह कम p75 ^{एनटीआर} आधारित panning प्रक्रिया की तुलना में महंगा है, और लेक्टिन अधिक एंटीबॉडी से अधिक स्थिर है. संवर्धन छवि में सूचीबद्ध है. 2 और टैब. 1 से पता चलता है कि प्रक्रिया कोशिकाओं के समान संख्या की शुद्धि के लिए अनुमति देता है और इन कोशिकाओं के बहुमत है कि motoneuron मार्कर आइलेट – 1 / 2 व्यक्त करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण कदम काठ का रीढ़ की हड्डी के लिए अलग प्रक्रिया है. Meninges और DRGs (छवि 2) निकालना लेक्टिन आधारित preplating द्वारा निम्नलिखित शोधन प्रक्रिया के लिए आवश्यक है. यदि यह सही ढंग से प्रबंधित किया गया है, लगभग सभी कोशिकाओं p75 ^{एनटीआर} व्यक्त है (प्रतिनिधि तस्वीर के लिए चित्र देखें 3a. ). आइलेट-1 / 2 की अभिव्यक्ति और p75 ^{एनटीआर} सबसे शायद के बीच अंतर के लिए कारण है क्योंकि काठ ^motoneurons विभिन्न 10 आइलेट – 1 / 2 के उच्च और निम्न स्तर व्यक्त. Immuncytochemical धुंधला हो जाना और बाद में गिनती में आइलेट-1 अभिव्यक्ति / 2 के निम्न स्तर के मामले में यह हमारे ध्यान में बच सकता है के रूप में हम सकारात्मक बनाम नकारात्मक कोशिकाओं (1 Tab.) के लिए सम्मान के साथ कड़े थे. इसके अतिरिक्त, तालिका 1 स्पष्ट रूप से पता चलता है कि एक स्वस्थ हालत में अलग कक्षों प्रक्रिया जीवित रहने के रूप में वहाँ केवल कुछ trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं है कि संकेत मिलता है कि कोशिकाओं अचल क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. इस alterative प्रक्रिया भी एकल और इसलिए भ्रूण भ्रूण चूहों से मिश्रित जीनोटाइप litters से motoneurons के अलगाव की अनुमति देता है. अंत में, p75 ^{एनटीआर 6} एंटीबॉडी के साथ panning प्रक्रिया के लिए इस विकल्प के समान है नहीं तो संभव आवेदन पर्वतमाला के मामले में समान क्षमता और माउस भ्रूणीय motoneurons के लिए एक सस्ता और कुशल वैकल्पिक शुद्धि विधि प्रदान करता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Poly-DL-ornithine hydrobromide	Sigma	P8638
Laminin	Invitrogen	23017-015
HBSS	Gibco	14170
Glass coverslips	Thermo		Ø 10 or 14mm
Lectin	Sigma	L5142
Cell culture dish	Nunc	150350	Nunclon delta surface
Horse serum	Linaris	SHD3250ZK	Each batch has to be tested for MN culture
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-038
CNTF	Sigma	N0513
BSA	Applichem	A1391
Neurobasal	Gibco	21103-041
Forceps			Stainless steel, size 4 or 5
Trypsin	Worthington	LS003707
Trypsin-Inhibitor	Sigma	T6522
Anti-Islet-1	DSHB	39.4D5	Cell culture supernatant
Anti-Nkx6.1	DSHB	F55A10	Cell culture supernatant
Anti-p75NTR	Abcam	Ab8874

Table 3. Table of specific reagents and equipment.