الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية
Summary
تلوث استعدادات حقيقية النواة ريبوسوم تنقيته بواسطة الطرق التقليدية التي شاركت في تنقية nucleases البروتياز ويؤثر سلبا على مجرى النهر التحاليل البيوكيميائية والهيكلية. ويتم استخدام أسلوب بسيط وسريع لتنقية الكروماتوغرافي لحل هذه المشكلة باستخدام الخميرة ريبوسوم كنظام النموذج.
Abstract
ريبوسوم حقيقية النواة هي أكثر عطوب بالمقارنة مع نظرائهم eubacterial وarchael ، مما يشكل تحديا كبيرا للباحثين. مزعجا بشكل خاص هو حقيقة أن تحلل الخلايا النشرات عددا كبيرا من البروتياز وnucleases التي يمكن أن تتحلل ريبوسوم. وبالتالي ، فمن المهم لفصل ريبوسوم من هذه الإنزيمات في أسرع وقت ممكن. للأسف ، الطرق التقليدية تنبيذ فائق الفرق ريبوسوم يترك عرضة لهذه الانزيمات لفترات طويلة من الزمن بشكل غير مقبول ، مما يؤثر على سلامتها الهيكلية والوظيفية. لمعالجة هذه المشكلة ، ونحن استخدام أسلوب الكروماتوغرافي باستخدام السيستين اتهم Sulfolink الراتنج. هذا التطبيق بسيطة وسريعة يقلل بشكل ملحوظ شارك في أنشطة تنقية وnucleolytic بروتين ، وتنتج غلة عالية من سليمة ، ريبوسوم الخميرة النشطة كيميائيا للغاية. نقترح أن هذا الأسلوب يجب أن ينطبق أيضا على ريبوسوم الثدييات. بساطةالأسلوب ، والنقاء ، وتعزيز نشاط الريبوسوم المنقى chromatographically يمثل تقدما كبيرا التقنية لدراسة ريبوسوم حقيقية النواة.
Protocol
Discussion
بروتوكولات أساسية تشمل تنقية الريبوسوم الخلايا lysing وحصاد جزء من عصاري خلوي تدور بسرعة منخفضة ، والتكوير ثم ريبوسوم بواسطة الطرد المركزي بسرعة عالية 1. في حين تم استخدام أساليب الرواية قليلة لتنقية ريبوسوم البكتيرية ، وكان نفس لم ينطبق على حقيقيات النوى 2-4.</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر Dinman ، بما في ذلك Belew أشتون ، جاك كارين ، Musalga Sharmishtha ، Sulima سيرجي ريدي شيفاني ، ومايكل Rhodin لما قدموه من مساعدة والمساهمة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل عن طريق منح لصباحا من جمعية القلب الأمريكية (AHA 0630163N) وJDD من المعاهد الوطنية للصحة (5R01 GM058859 – 12). وأيد جال قبل إعادة الاستثمار الأميركي وقانون الانتعاش عام 2009 تكملة لمنح الأم (3R01GM058859 – 11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
