Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen
Summary
Verontreiniging van de voorbereidingen van eukaryotische ribosomen gezuiverd door middel van traditionele methoden door co-zuiveren nucleasen en proteasen negatief effect op de downstream-biochemische en structurele analyses. Een snelle en eenvoudige chromatografische zuivering methode wordt gebruikt om dit probleem op met behulp van gist ribosomen als een modelsysteem op te lossen.
Abstract
Eukaryotische ribosomen zijn veel meer labiel in vergelijking met hun eubacteriële en archael tegenhangers, waardoor die een belangrijke uitdaging voor onderzoekers. Bijzonder lastig is het feit dat lysis van de cellen een groot aantal proteasen en nucleasen die kunnen afbreken ribosomen releases. Zo is het belangrijk om ribosomen te scheiden van deze enzymen zo snel mogelijk. Helaas, conventionele differentieel ultracentrifugatie methoden laat ribosomen blootgesteld aan deze enzymen voor onaanvaardbaar lange tijd, invloed zijn op hun structurele integriteit en functionaliteit. Om dit probleem, wij maken gebruik van een chromatografische methode met behulp van een cysteïne gebracht Sulfolink hars. Deze eenvoudige en snelle toepassing vermindert co-zuiverende proteolytische en nucleolytische activiteiten, het produceren van hoge opbrengsten van een intact, zeer biochemisch actieve gist ribosomen. Wij stellen voor dat deze methode ook moeten gelden voor zoogdieren ribosomen. De eenvoud vande methode, en de verbeterde zuiverheid en activiteit van chromatografisch gezuiverd ribosoom is een belangrijke technische vooruitgang voor de studie van eukaryotische ribosomen.
Protocol
Discussion
Ribosoom zuivering protocollen in principe te betrekken lyseren cellen, het oogsten een cytosolische fractie van een lage snelheid draaien, en dan pelletering ribosomen door de hoge snelheid centrifugeren 1. Terwijl een paar nieuwe methoden zijn gebruikt voor het zuiveren van bacteriële ribosomen, had hetzelfde niet geldt voor eukaryoten 2-4. Hoewel de extra stappen zijn toegevoegd aan de jaren, zoals het zout wast, en glycerol kussens (bijv. zie 5), hebben biochemische en structurele s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen iedereen bedanken van de leden van de Dinman laboratorium, waaronder Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, en Michael Rhodin voor hun hulp en inbreng aan dit project. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AM van de American Heart Association (AHA 0630163N) en JDD van de National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL werd ondersteund door een Amerikaanse Reinvestment and Recovery Act van 2009 aan te vullen aan de ouder-subsidie (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
