טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל
Summary
זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.
Abstract
הריבוזומים האיקריוטים הם הרבה יותר יציב לעומת עמיתיהם eubacterial ו archael שלהם, ובכך פוזות אתגר משמעותי לחוקרים. מדאיג במיוחד הוא העובדה תמוגה של תאים משחרר מספר גדול של פרוטאזות ו nucleases אשר יכול לבזות הריבוזומים. לכן, חשוב להפריד בין הריבוזומים של אנזימים אלה מהר ככל האפשר. למרבה הצער, שיטות קונבנציונליות ultracentrifugation ההפרש עלים הריבוזומים חשופים אנזימים אלה לתקופות ארוכות של זמן בלתי מתקבל על הדעת, המשפיעים על השלמות המבנית ואת הפונקציונליות שלהם. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מנצלים שיטה chromatographic באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף. יישום פשוטה ומהירה מפחית באופן משמעותי את שיתוף טיהור פעילויות proteolytic ו nucleolytic, ייצור של תשואות גבוהות, ריבוזומים שלמים שמרים מאוד פעיל ביוכימית. אנו מציעים שיטה זו צריך להיות גם ישים הריבוזומים יונקים. הפשטות שלהשיטה, ועל טוהר פעילות משופרת של הריבוזום מטוהרים chromatographically מייצג התקדמות טכניים משמעותיים לחקר הריבוזומים האיקריוטים.
Protocol
Discussion
פרוטוקולים טיהור ריבוזום בעצם כרוך תאים lysing, קצירת חלק מן cytosolic ספין במהירות נמוכה ולאחר מכן pelleting הריבוזומים על ידי צנטריפוגה מהירות גבוהה 1. בעוד כמה שיטות הרומן שימשו לטיהור הריבוזומים חיידקי, אותו לא היה נכון לגבי אאוקריוטים 2-4. למרות צעדים נוספים נוספ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לכל חברי המעבדה Dinman, כולל אשטון Belew, קארן ג'ק, Sharmishtha Musalga, סרגיי Sulima, Shivani Reddy, מיכאל רודין על עזרתם קלט על הפרויקט הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AM מן איגוד הלב האמריקני (AHA 0630163N) ו JDD מן המכונים הלאומיים לבריאות (5R01 GM058859-12). ג'אל נתמכה על ידי מהשקעה Recovery Act האמריקאי תוספת של 2009 כדי להעניק את ההורה (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
