Хроматографической очистки высокоактивной рибосомы дрожжей
Summary
Загрязнение подготовки эукариотических рибосом очищают традиционными методами путем совместной очистки нуклеаз и протеаз отрицательно влияет на течение биохимических и структурных анализов. Быстрый и простой хроматографический метод очистки используется для решения этой проблемы с помощью дрожжей рибосомы в качестве модельной системы.
Abstract
Эукариотической рибосомы являются гораздо более лабильны по сравнению с их эубактерий и archael коллег, что создает серьезную проблему для исследователей. Особенно беспокойство тот факт, что лизис клетки-релизы большое количество протеаз и нуклеаз, которые могут ухудшить рибосом. Таким образом, важно, чтобы отдельные рибосом из этих ферментов как можно быстрее. К сожалению, обычные методы дифференциального центрифугирования листьев рибосомы подвергаются воздействию этих ферментов для неприемлемо длительных периодов времени, воздействуя на их структурной целостности и функциональности. Для решения этой проблемы, мы используем хроматографический метод с использованием цистеин взимается Sulfolink смолы. Это простое и быстрое применение значительно снижает совместно очистки протеолитических и nucleolytic деятельность, производя высокие урожаи нетронутыми, высоко биохимически активные рибосомы дрожжей. Мы полагаем, что этот метод должен быть применим и к млекопитающим рибосом. Простотаметод, и расширение чистоты и активности хроматографически очищенный рибосома представляет собой значительный технический прогресс в изучении эукариотических рибосом.
Protocol
Discussion
Рибосома протоколы очистки в основном связаны с лизису клеток, уборка цитозольного фракции низкой скорости вращения, а затем гранулирования рибосомы высокой скорости центрифугирования 1. Хотя несколько новых методов были использованы для очистки бактериальных рибосом, то же не…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Dinman, в том числе Эштон Белью, Карен Джек, Sharmishtha Musalga, Сергей Сулима, Шивани Редди, и Майкл Родин за их помощь и информацию по этому проекту. Эта работа была поддержана грантами А. М. от Американской ассоциации сердца (AHA 0630163N) и JDD из Национального института здоровья (5R01 GM058859-12). JAL была поддержана американской реинвестирования и восстановлению Закон 2009 года дополнением к родителю гранта (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
