Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad
Summary
La contaminación de las preparaciones de los ribosomas eucarióticos purificado por los métodos tradicionales de purificación de nucleasas y proteasas co-incide negativamente en posteriores análisis bioquímicos y estructurales. Un método de cromatografía de purificación rápida y sencilla se utiliza para resolver este problema con los ribosomas levadura como un sistema modelo.
Abstract
Ribosomas eucariotas son mucho más lábiles en comparación con sus contrapartes eubacterial y archael, lo que plantea un importante reto para los investigadores. Particularmente preocupante es el hecho de que la lisis de las células libera una gran cantidad de proteasas y nucleasas que pueden degradar los ribosomas. Por lo tanto, es importante separar los ribosomas de estas enzimas lo más rápido posible. Desafortunadamente, los métodos convencionales de ultracentrifugación diferencial ribosomas hojas expuestas a estas enzimas por períodos excesivamente largos de tiempo, afectando su integridad estructural y funcionalidad. Para solucionar este problema, utilizamos un método de cromatografía de cisteína con un cargo Sulfolink resina. Esta aplicación sencilla y rápida reduce significativamente co-purificación de las actividades proteolíticas y nucleolytic, produciendo altos rendimientos de los ribosomas intactos, levadura muy bioquímicamente activas. Sugerimos que este método debería ser aplicable también a los ribosomas de mamíferos. La simplicidad deel método, y la pureza mejorada y la actividad de los ribosomas cromatográficas representa un avance técnico importante para el estudio de los ribosomas eucarióticos.
Protocol
Discussion
Protocolos de purificación de ribosomas en esencia, de las células de lisis, cosecha una fracción citosólica de un giro a baja velocidad, y luego granulación ribosomas por centrifugación de alta velocidad 1. Mientras que un nuevos métodos se han utilizado algunos para la purificación de los ribosomas bacterianos, la misma no había sido cierto para los eucariotas 2-4. A pesar de las medidas adicionales han sido añadidos a lo largo de los años, por ejemplo, se lava la sal, y los cojines de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a todos los miembros del laboratorio Dinman, incluyendo Ashton Belew, Jack Karen, Musalga Sharmishtha, Sulima Sergey, Reddy Shivani, y Michael Rhodin por su ayuda y aportación en este proyecto. Este trabajo fue apoyado por becas de AM de la American Heart Association (AHA 0630163N) y JDD de los Institutos Nacionales de Salud (5R01 GM058859-12). JAL fue apoyado por una de Reinversión y Recuperación Americana de 2009, suplemento al título principal (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
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