Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma
Summary
Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.
Abstract
Ökaryotik ribozomlar, böylece araştırmacılar için önemli bir meydan okuma poz eubacterial ve archael muadillerine göre çok daha dayanıksız. Özellikle sorunlu hücrelerin parçalanması, proteaz ve ribozomlar düşürebilir nükleazlar çok sayıda serbest olduğu bir gerçektir. Bu nedenle, mümkün olduğunca çabuk bu enzimler ribozom ayırmak için önemlidir. Ne yazık ki, geleneksel diferansiyel Ultrasantrifügasyon yöntemleri, yapısal bütünlüğünü ve işlevselliğini etkileyen bu enzimler zaman kabul edilemeyecek kadar uzun süre maruz ribozomlar bırakır. Bu sorunu çözmek için, bir sistein ücret Sulfolink reçine kullanarak kromatografik yöntem kullanmaktadır. Bu basit ve hızlı uygulama, sağlam, yüksek biyokimyasal aktif maya ribozomların yüksek verim üreten ortak arıtma proteolitik ve nucleolytic faaliyetleri, önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem aynı zamanda memeli ribozomlar için geçerli olması gerektiğini düşündürmektedir. Sadeliğiyöntemi ve ökaryotik ribozomlar çalışma için önemli bir teknik ilerleme, kromatografik saflaştırılmış ribozom gelişmiş saflık ve aktivite gösterir.
Protocol
Discussion
Ribozom arıtma protokolleri temelde düşük hızda spin sitozolik bir fraksiyonu hasat parçalama hücreleri içerir ve daha sonra yüksek hızda santrifüj 1 ribozomlar peletleme . Bakteri ribozomları temizlemek için bir kaç yeni yöntemler kullanılmış olsa da, aynı ökaryotlar 2-4 için doğru değildi. Maya ribozomlar biyokimyasal ve yapısal çalışmalar ek adımlar yaş, örneğin tuz yıkama ve gliserol minderler (örneğin: 5) boyunca eklenmiş olmasına rağmen, büyük…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ashton Belew, Karen Jack Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima Shivani Reddy ve onların yardım ve bu projenin giriş Michael Rhodin Dinman laboratuvar üyeleri, teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AHA 0630163N), AM ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01 GM058859-12) JDD bağışları ile destek verdi. JAL, 2009 ek ana hibe bir Amerikan Yatırım ve Kurtarma Yasası (3R01GM058859-11S1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
