负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物：从电网的制备图像采集

Summary

负染色电子显微镜（EM）的可视化蛋白质样品已成为一种流行的结构分析方法。它是有用的定量结构分析，如计算一个正在研究的分子的三维重建，也为蛋白质制剂质量的定性检查。在这篇文章中，我们目前准备的EM电网，染色样品，并在电子显微镜下的可视化样品的详细协议。新手用户可以轻松地遵循这些协议，并利用负染作为常规检测EM，除了其他生化分析评估其蛋白质样品，。

Abstract

负染色或冷冻水合生物样品的单粒子电子显微镜（EM），已成为一个多功能的工具，在结构^生物学 1 。近年来，这种方法已取得了巨大的成功，研究蛋白质和大分子复合^物2，3结构。电子低温显微镜（cryoEM），其中冷冻水合蛋白样品是在一层薄薄的玻璃体冰⁴的嵌入式相比，负染色是一个简单的样品制备方法，其中蛋白质样品嵌入一层薄薄的干重金属盐，以增加标本的对比^5。负染色增强对比EM允许相对较小的生物样品的检查。此外，以确定三维（3D）纯化蛋白质或蛋白质复合物⁶的结构，这种方法可以用于更广泛的用途。例如，负染色的EM可以很容易地使用可视化纯化蛋白质样品，获得信息，如同质/异质性的样品，蛋白质复合物或大型集会的形成，或简单地评价一种蛋白质制剂的质量。

在这个视频文章中，我们提出一个完整的协议使用的EM观察负染蛋白质样品，准备为负碳包覆电网收购在加速电压在120KV经营电子显微镜负染样品图像污渍的EM。这些协议已在我们的实验室常规新手用户可以很容易地遵循。

Protocol

1。电磁电网碳涂层的制备填充用蒸馏水的大烧杯。 使用玻璃吸管砸在水面单一的火棉胶（〜20μL，2％戊酯，电子显微镜学，PA，美国）下降。火棉胶将蔓延在水/空气表面，形成一个薄薄的塑料层;注意：可用于任何尘埃颗粒清除水面的火棉胶的首次下降。从第一个下拉膜中取出后，水面上的灰尘清晰。 广场的EM电网，400或200目吉尔德铜电网购特德佩拉公司（美国），一个个浮于水面上的塑料层，我们通常的地方​​50〜100电网在一个紧密的包装图案，与光泽方电网面临的塑料层（图1A）。注：400目网格常规负染的EM电网;而200目网格收集倾斜对图像。 剪下一个馅饼CE纸张尺寸比电网的塑料层上放置的面积略大一些。仔细将纸张顶部的网格（图1B），等到纸张变得完全湿（图1C）。注：不同类型的纸张有不同的水的吸收率。重要的是，纸张不吸收水分太快。例如，定期的滤纸是不是为此目的，因为它吸收水分过快使得很多皱纹。碳薄膜皱纸不平整，从而不能收集随机的锥形倾斜三维重建倾斜对图像良好。来测试不同的文件，以找到一个合适的的。在我们的实验室，我们一直使用从当地的杂货店买的记事本文件。有时报纸的纸张也发现是合适的。另一种选择是使用相对厚的宣纸用于中国/日本书法。 迅速作出周围切口上的塑料薄膜和接近浸泡过的纸。紧接着，使用一对镊子，拿起纸与塑料薄膜和纸张之间夹着网格。放置在培养皿纸与电网所面临的空气干燥（图1D）;注意：重要的是让纸张风干。干燥过快产生许多皱纹的文件。 2。碳涂层网格在我们的实验室中使用的碳涂布机是一个Cressington 208C高真空涡轮增压碳镀膜机（泰德佩拉）。我们的系统配备一个Cressington薄膜厚度的显示器，该措施的原则的基础上涂碳薄膜的厚度，石英晶体的振荡频率是在其表面沉积薄膜的质量改变。然而，协议在这里不需要厚度的显示器，因为它往往不是在每一个实验室。 锐化使用卷笔刀（泰德佩拉）和负载炭棒中碳涂层米碳棒achine（图2A）。两棒，用锋利的尖端和其他与平坦的放置互相反对。 应用真空润滑脂磨砂载玻片面积的一半，并把它旁边电网（图2B）。只有一半的载玻片磨砂面积应包括真空润滑脂。注：真空润滑脂面积不会改变碳涂层后的颜色。真空润滑脂与邻近地区之间的对比提供了一种涂碳的厚度估计。 广场与舞台上的碳涂布机电网的纸张。将载玻片电网（图2C）。注：你也可以用塑料薄膜载玻片涂电网首次转让涂装前，很多情况下电网下降从纸张。 泵的真空室，等到真空达到10-5托的水平。注：低真空镀膜往往会产生许多火花，导致许多大型的碳粒子网格。 增加当前非常缓慢。碳棒的锐利尖端会先变成红色，然后作为当前增加的白色。不要用肉眼直接观看高亮度提示。停止增加涂层启动时的电流。载玻片上会改变颜色从白色，浅灰色和深灰色。黑暗幻灯片的关联被涂碳薄膜的厚度。关闭当前的关闭停止涂层时所需的厚度已经达到（图2D）。注：1）经过反复的碳涂层工艺，玻璃钟罩内涂碳，其颜色变暗。这使得涂碳膜厚度大于它实际上是。 2）一个削尖的碳棒可用于几个涂层。每次涂后逐渐减少提示的清晰度。最大电流是影响碳棒的清晰度。一个直径较小的新鲜削尖杆需要一个相对较低的当前蒸发碳。后来涂层可能需要略高的电流。 放空真空室，取出后用涂电网。 注1：控制碳厚度更精确的方法是使用薄膜的厚度监视器。或者可以定性校准对精确的厚度测量显示器的颜色。这种技术的一个有用的碳厚度为3至7纳米。 这是一个简单的方法，准备大量的碳包覆电网，通常〜100％准备网格。网格包含一个薄薄的塑料层，它通常不会影响负染图像的质量。然而，在此方法制备的网格是不适合用于cryoEM。这层塑料可以去掉浸泡了几个小时到氯仿电网。 3。准备铀甲酸溶液（0.75％）为负染色的EM。详细的协议此前5介绍到小烧杯称取37.5mg铀酸盐; 添加5毫升的开水，搅拌5分钟在黑暗中; 加入10μL5M NaOH溶液，继续搅拌5分钟; 过滤器的解决方案，使用注射器过滤器（Fisherbrand，13毫米注射器过滤器，0.2μm的尼龙非无菌，目录编号09-720-5），并存储在一个覆盖着铝箔的8毫升猎鹰管过滤的解决方案; 注意。铀酸盐粉末，就可以买到从电子显微镜科学（哈特菲尔德，PA），目录号22451 。铀酸盐的解决方案是光敏感，应尽量远离直射光线，例如，通过覆盖猎鹰管铝箔。新鲜配制的解决方案有一个浅黄色（图3A）。染色解决方案，可以保持一到两周之前开始沉淀在板凳上。铀酸盐是酸性的pH〜4。加入NaOH的pH值增加，但增加速度太快或过量可导致色斑沉淀。除了产生对比，铀酸盐也修复的蛋白质样品。由于固定利率是如此之快，低pH值通常不影响整体的蛋白质构象或蛋白质复合物的形成 7 。 4。准备负染色EM网格的议定书“。该协议是此前5详细描述辉光放电的碳镀膜网格，使用Pelco easiGlow GlowDischarge系统（特德佩拉公司，美国）。当前使用的是15 mA和网格为30秒。 注意出院焕发。辉光出院电网，辉光放电后不久，应使用。我们经常使用的辉光放电后在不到2个小时的网格。 将两个20μL滴蒸馏水和两个铀酸盐溶液25μl滴在一块的封口膜（图3B）。 保持辉光放电的网格，与汽车使用反向力抗毛细管钳碳涂层的一面朝上。注：这是有必要使用抗毛细管钳。否则，液体样品将被吸走从电网由毛细管力之间的镊子。 应用2μL蛋白质样品辉光放电的电网，并等待30秒。注：等待时间和辉光放电的长度影响吸附在网格蛋白的浓度。非常稀释的样本，需要更长的吸附倍。然而，长时间吸附，可能会改变，因为水蒸汽的缓冲液浓度。为了达到适当的粒度分布在电网需要有些试验和错误做法。 用滤纸吸干样本。 触摸网格表面的水滴，然后水用滤纸吸干。重复与水的第二次下降。 触摸网格表面的污渍简要的首次下降。用滤纸吸干污渍的解决方案。 触摸网格表面的色斑20秒第二个下拉。印迹ØFF染色溶液用滤纸。 使用真空干燥电网。注：也可以留在板凳上，或在空气干燥的化学物质罩网格。真空干燥的好处是可以立即观察在EM电网。快干产生可能的神器是不均匀的色斑。 5。透射电子显微镜在这个演示中使用的显微镜​​（FEI公司）与一个加坦的4K x 4K CCD相机配备一个Tecnai的T12。 简单插入样品前检查显微镜对齐;注意：这是只需要每一次的EM会议。在一个模型显微镜中，近乎完美的对齐可以保存。载入这样的一个对齐文件应恢复显微镜对准了近乎完美的条件。 装入单倾斜的标准试样座EM网格。 插入CompuStage的T12的持有人。抽水周期，等待完成。 插入列持有人。</ LI> 焦点标本，并设置所需的散焦，通常1.5um。注：基础，可以实现手动对焦使用最低对比的方法，或使用CCD相机，捕捉到的实时图像和计算生活傅立叶功率谱。 使用CCD相机记录图像; 在图像的负面染色的蛋白质样品，蛋白质往往被与白的对比，即对一个比较暗的背景色的白色密度。请注意，而不同地区的同一电网中的蛋白质含量通常都颇为相似，不观察不同领域不同层次的染色在同一电网。有时地区可能有不均匀染色或染色阳性（蛋白质出现白底黑字），而其他一些地区有完善的污渍。它往往是必要的网格搜索找到一个良好的成像面积的。 6。代表性的成果典型的良好形象产生负面STA的例子独立非执行董事的样本，马脾铁蛋白（图4A），厂（图4B），古20S蛋白酶体（图4c）和核小体（图4D），显示。 图1。制备碳包覆电网为负染色的EM。）配售EM电网在火棉胶薄膜表面上的封闭包装图案由一。 b）将一块略高于网格面积较大的纸张。三）等待，直到纸张得到完全湿。四）拿起纸连同空气干燥的电网。 图2。 。涂层的EM电网与碳一）设置的碳蒸发器：在涂料仪器的两个碳杆，以一杆削尖点提示（左）。其他杆（右）在平坦的表面，并在接触与在对面s的一个点提示IDE。 b）放置在一个培育的载玻片的一侧少量的真空油脂。黑框内的面积真空润滑脂。 c）设置为涂层的电网。玻片用于保存的文件位置。箭头指向真空润滑脂的区域。 d）在涂层，覆盖与真空油脂的幻灯片的颜色不改变颜色。对比表明涂碳的厚度。 图3。说明负染色过程A）刚准备（左）铀酸盐的解决方案是透明无沉淀的迹象。 1〜2周后，沉淀在试管底部的底部开始积累。 b）将蒸馏水和铀在一块的封口膜甲酸溶液滴两滴（约25μl）。使用一对反毛细管钳与碳端辉光排出的碳包覆EM网格起来。下降的样品（〜2μL）是放置在网格中。 c）在等待30秒，印迹滤纸的解决方案。四）翻转网格网格的样品侧接触水的首次下降。重复步骤C和D来完成染色过程。 图4。负染蛋白质样品EM图像的例子。）马脾铁蛋白中的B）片段的抗原结合（FAB），C）古细菌20S蛋白酶体和D）核小体。所有图像记录具有相同的放大倍率。比例尺是20nm的。

Discussion

负染色EM是一个强大的工具，可以用来研究纯化的蛋白质样品的三维结构，如使用随机^的锥形倾斜8方法，它需要从试样倾斜至60 °，并收集来自同一地区的一对图像，但untilted，计算大分子复合体的三维重建。此外，负染EM可以有许多其他应用，如二维（2D）的膜蛋白⁹晶体筛选，观察在不同的构象^10，或者干脆进行可视化从而纯化的蛋白质样品的均匀性和/或异质性的蛋白质复合体提供反馈，以提高蛋白质纯化程序，等它可以是一个强大的生物化学检测。在这篇文章中，我们提出的协议，从准备收集在电子显微镜负染的蛋白质样品图像的碳包覆电网。如下图所示，程序比较简单，易于遵循。如果试图计算由随机的锥形倾斜方法观察到的样品的三维重建，这是必要的收购倾斜对图像。但是，如果进行单粒子分析的目的是，多个untilted图像就足够了。在这两种情况下，进一步的图像处理是必要的，这超出了这个视频文章的范围。

任何方法，有变化的协议。铀酸盐作品非常好，在大多数情况下为负染色试剂。醋酸铀是另一种常用的负染试剂。它的工作原理非常相似铀酸盐，但更大的晶粒尺寸，并在许多情况下，低于铀酸盐的对比。使用醋酸铀的好处是，解决方案的持续时间长于铀酸盐。一个并不需要每隔一至两个星期准备一个新的解决方案。两个铀甲酸和醋酸的酸性。一个明显的关注的是，低pH值可诱导在被研究的蛋白质样品的变化。两种染色的解决方案也可作为蛋白固定剂。早先的研究已经表明，这两个修复蛋白样品^迅速 7 。这种快速的固定低pH值不太重要。在染色过程中，成为一个蛋白质样品固定前低的pH值可诱导任何更改。然而，其他如钼酸铵和磷钨酸负染试剂，可能会产生更好的效果染色样品时，低pH值是^关注 7 。钼酸铵和磷钨酸约中性pH值，但这些污渍产生的蛋白质样品的对比度通常比铀酸盐。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collodion	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	12620-30	30ml, 2% in Amyl Acetate
Gilder Cu grids	Ted Pella Inc., USA	G400/G200	400/200 mesh
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella Inc., USA	9260
Double pointed Carbon rod	Ted Pella Inc., USA	58
Uranyl formate	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	16984-59-1	99.9% purity
PELCO easiGlow GlowDischarge system	Ted Pella Inc., USA	91000	Purchase at local pharmacy
Whatman #1 Filter paper	Fisher Scientific	09-805E