Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Summary

Ein Ein-Schritt-RT-PCR-Assay zum Nachweis und zur Genogruppe Identifizierung von Norovirus Isolate von Kindern der Stuhl, die Primer und TaqMan-Sonden spezifisch für die offenen Leserahmen 1 (ORF1)-ORF2 Übergangsregion, die am stärksten konservierte Region des Norovirus Genom verwendet beschrieben. Eine nicht-kommerzielle, kostengünstige RNA-Extraktion-Methode wird ausführlich beschrieben.

Abstract

Noroviren (NoVs) sind die führende Ursache von Ausbrüchen der sporadischen akuten Gastroenteritis weltweit bei Menschen aller Altersgruppen. Sie sind wichtige Ursachen für Hospitalisierungen bei Kindern mit einer gesundheitlichen Auswirkungen ähnlich der von Rotavirus. NoVs sind RNA-Viren von großer genetischer Vielfalt und es gibt eine kontinuierliche Auftreten neuer Stämme. Fünf Genogruppen anerkannt werden; GI und GII mit ihren vielen Genotypen und Subtypen das wichtigste für eine Infektion beim Menschen. Allerdings ist die Diagnose dieser beiden Genotypen problematisch, Verzögern Diagnose und Behandlung. ^{1, 2, 3}

Für die RNA-Extraktion aus Stuhlproben der am häufigsten verwendete Methode ist die QIAmp Viral RNA kommerziellen Kit von Qiagen. Dieses Verfahren kombiniert die Bindungseigenschaften eines Silicagelmembran, Puffer, dass die Kontrolle RNasen und eine optimale Bindung der RNA an der Säule zusammen mit der Geschwindigkeit des MicroSpin. Diese Methode ist einfach, schnell und zuverlässig und ist Carrin wenigen Schritten, die in der Beschreibung des Herstellers detailliert sind IED.

Norovirus ist nur noch von Rotavirus als die häufigste Ursache von Durchfall. Norovirus-Diagnostik sollte in allen Studien über die Pathogenese von Durchfall als auch in Ausbrüchen oder einzelne Durchfall Fällen zur Verfügung. Derzeit jedoch Norovirus Diagnose ist auf nur wenigen Zentren aufgrund des Fehlens von einfachen Methoden der Diagnose beschränkt. Dies verzögert Diagnose und Behandlung ^{1, 2, 3.} Darüber hinaus bedienen sich aufgrund der hohen Kosten und geregelten Transport von korrosiven Puffer innerhalb und zwischen den Ländern dieser gefertigten Bausätze wirft logistische Probleme. Als Ergebnis werden in diesem Protokoll beschreiben wir eine Alternative, wirtschaftlichen, Hausmethode die auf der ursprünglichen basiert Boom et al. Verfahren ^4, die die Nukleinsäure-bindenden Eigenschaften von Siliciumdioxid-Teilchen verwendet zusammen mit den Anti-Nuklease Eigenschaften Guanidiniumthiocyanat .

<p class="Jove_content"> Für die Erkennung und genogrouping (GI und GII) von NoVs Isolate aus Stuhlproben, mehrere RT-PCR-Protokolle, die unterschiedliche Ziele entwickelt worden. Der Konsens ist, dass eine RT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Chemie wäre die beste Methode zur molekularen Diagnose sein, weil es hohe Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit mit hohem Durchsatz und einfache Bedienbarkeit vereint. Hier beschreiben wir einen Assay zur Förderung der offenen Leserahmen 1 (ORF1)-ORF2 Übergangsbereich, die am stärksten konservierte Region des Genoms und daher NoV am besten geeignet für die Diagnose. Für weitere genetische Analyse eine konventionelle RT-PCR, die die hoch variablen N-terminalen-Schale-Ziele aus der Haupt-Protein des Kapsids (Bereich C) unter Verwendung der Primer ursprünglich von Kojima et al. ⁵ beschrieben. Die Sequenzierung des PCR-Produkt aus der herkömmlichen PCR ermöglicht die Unterscheidung von Genotypen aus der GI und GII Genogruppen.

Protocol

1. Stuhlproben Stuhlproben sollten eingefroren gelagert, um die RNA zu bewahren. Um eine 10% fäkal Federung machen, dauert ca. 0,1 g aufgetauten Stuhlprobe und füllen auf 1 ml mit PBS. Aliquotieren in 200 ul zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Lagern Sie die Aliquots bei -70 ° C. Auftauen und zentrifugieren Aliquots bei 4.000 g für 10 min vor der Verwendung in Extraktion. 2. Vorbereitung von Silica-Partikeln für die Extraktion mit Guani…

Discussion

Mit dem wirtschaftlichen Inhouse-Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäure aus Stuhlproben, erhalten wir gleiche Ergebnisse wie mit dem kommerziellen QIAmp Viral RNA Kit von Qiagen, und zusammen mit der TaqMan RT-PCR in unserem Labor entwickelt können wir erkennen ein breites Spektrum von NOV Genotypen aus der GI und GII Genogruppe. Eine aktuelle Publikation der Region C-Protokoll berichtet Genotypisierung Raten von 78% ^6. Da die Vielfalt der zeitgenössischen NoV Stämme hat sich in den vergangenen Jahren …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100