Rilevamento e Genogrouping di Norovirus dalle feci dei bambini By Taqman One-step RT-PCR

Summary

Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l'identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell'RNA è dettagliato.

Abstract

Norovirus (NoVs) sono la principale causa di sporadici focolai di gastroenterite acuta in tutto il mondo negli esseri umani di tutte le età. Essi sono causa importante di ospedalizzazione nei bambini con un impatto sulla salute pubblica simile a quella del Rotavirus. NoVs sono virus a RNA di grande diversità genetica e vi è una continua comparsa di nuovi ceppi. Cinque genogruppi sono riconosciuti, GI e GII con i loro numerosi genotipi e sottotipi che sono i più importanti per l'infezione umana. Tuttavia, la diagnosi di questi due genotipi resta problematica, ritardando diagnosi e trattamento. ^{1, 2, 3}

Per l'estrazione di RNA da campioni di feci il metodo più comunemente usato è il kit QIAmp Viral RNA commerciale da Qiagen. Questo metodo combina le proprietà di legame di una membrana di gel di silice, che RNasi buffer di controllo e fornire vincolanti ottimali degli RNA alla colonna insieme alla velocità di MicroSpin. Questo metodo è semplice, veloce ed affidabile ed è carried in alcuni passaggi che sono dettagliati nella descrizione fornita dal produttore.

Norovirus è secondo solo al rotavirus come la causa più comune di diarrea. La diagnosi Norovirus dovrebbero essere disponibili in tutti gli studi sulla patogenesi della diarrea come pure in caso di focolai o di casi di diarrea individuali. Attualmente tuttavia la diagnosi norovirus è limitata a pochi centri a causa della mancanza di semplici metodi di diagnosi. Questa diagnosi ritardi e trattamento ^{1, 2, 3.} Inoltre, a causa dei costi di trasporto e regolamentato di buffer corrosivi all'interno e tra i paesi l'uso di questi kit manufatti pone problemi logistici. Come risultato, in questo protocollo descriviamo alternativa, economico, internamente metodo che si basa sulla originale Boom et al. ⁴ metodo che utilizza le proprietà di legame di acido nucleico di particelle di silice insieme alle proprietà anti-nucleasi tiocianato di guanidinio .

<p class=""> "Jove_content" Per l'individuazione e la genogrouping (GI e GII) NoVs di isolati da campioni di feci, diversi RT-PCR che utilizzano protocolli diversi target sono stati sviluppati. Il consenso è che una RT-PCR TaqMan utilizzando la chimica sarebbe la migliore tecnica molecolare per la diagnosi, perché unisce alta sensibilità, specificità e riproducibilità con elevata produttività e facilità d'uso. Qui si descrive un saggio di targeting la lettura aperta telaio 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma NoV e quindi più adatto per la diagnosi. Per ulteriori analisi genetica un convenzionale RT-PCR che gli obiettivi del altamente variabile N-terminale-shell dal principale proteina del capside (Regione C) utilizzando primers originariamente descritti da Kojima et al. ⁵ è dettagliato. Il sequenziamento del prodotto di PCR dal convenzionale PCR consente la differenziazione di genotipi appartenenti al GI e genogruppi GII.

Protocol

1. I campioni di feci Campioni di feci devono essere congelati e conservati per conservare l'RNA. Per effettuare una sospensione al 10% nelle feci, prendere circa 0,1 g di campione scongelato e completare a 1 ml con PBS. Aliquotare in 200 microlitri per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Conservare le aliquote a -70 ° C. Sciogliere e centrifugare le aliquote a 4000 g per 10 min prima dell'uso in estrazione. 2. Preparazione di particelle…

Discussion

Utilizzando la economico in casa metodo per isolare acido nucleico da campioni di feci, si ottengono risultati uguali come con il commerciale Viral QIAmp RNA kit da Qiagen, e insieme con la RT-PCR TaqMan sviluppato nel nostro laboratorio si può rilevare una vasta gamma di NoV genotipi appartenenti al GI e GII genogruppo. Una recente pubblicazione della regione C protocollo riportato tassi di genotipizzazione del 78% ^6. Dal momento che la diversità dei ceppi contemporanei nov è andato aumentando negli anni …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100