En enstegs RT-PCR-analys för detektion och gengrupp identifiering av Norovirus isolat från barn avföring, som utnyttjar primers och TaqMan-prober är specifika för den öppna läsramen 1 (ORF1)-ORF2 förbindelseregion, den mest konserverade regionen av Norovirus genomet är beskrivits. En icke-kommersiell, kostnadseffektiv RNA-extraktion metod detaljerade.
Norovirus (NoVs) är den vanligaste orsaken till utbrott av sporadisk akut gastroenterit i hela världen hos människor i alla åldrar. De är viktiga orsak till sjukhusinläggningar hos barn med en inverkan på folkhälsan som liknar rotavirus. NoVs är RNA-virus med stor genetisk mångfald och det finns en kontinuerlig uppkomsten av nya stammar. Fem genogrupper redovisas, GI och GII med sina många genotyper och subtyper är det viktigaste för människor infektion. Emellertid förblir diagnos av dessa två genotyper problematisk, fördröja diagnos och behandling. 1, 2, 3
För RNA-extraktion från avföringsprover den vanligast använda metoden är den QIAmp virala RNA kommersiellt kit från Qiagen. Denna metod kombinerar de bindande egenskaperna hos en silikagel-membran, buffertar som kontrollerar RNaser och tillhandahåller optimal bindning av RNA till kolonnen tillsammans med den hastighet MicroSpin. Denna metod är enkel, snabb och pålitlig och CarrIED i några steg som anges i den beskrivning som tillhandahålls av tillverkaren.
Norovirus är näst rotavirus som den vanligaste orsaken till diarré. Norovirus diagnosen bör finnas i alla studier av patogenes av diarré samt utbrott eller enskilda fall diarré. För närvarande dock norovirus diagnosen är begränsad till endast ett fåtal centra på grund av bristen på enkla metoder för diagnos. Detta fördröjningar diagnos och behandling 1, 2, 3. På grund av kostnader och reglerad transport av korrosiva buffertar inom och mellan länder användning av dessa tillverkade satser utgör logistiska problem. Som ett resultat, i detta protokoll beskriver vi ett alternativt, ekonomisk, intern metod som är baserad på den ursprungliga Boom et al. Metod 4, som använder den nukleinsyrabindande egenskaper kiseldioxidpartiklar tillsammans med de anti-nukleas egenskaper guanidiniumtiocyanat .
<p class="Jove_content"> För att upptäcka och genogrouping (GI och GII) av NoVs isolat från avföringsprov, flera RT-PCR protokoll använder olika mål har utvecklats. Enighet råder om att en RT-PCR med TaqMan kemi skulle vara det bästa molekylära tekniken för diagnos, eftersom den kombinerar hög känslighet, specificitet och reproducerbarhet med hög genomströmning och användarvänlighet. Här beskriver vi en analys målsökande den öppna läsramen 1 (ORF1)-ORF2 förbindelseregion, och den mest konserverade regionen av NOV-genomet och därmed mest lämplig för diagnos. För ytterligare genetisk analys av en konventionell RT-PCR-riktad mot den mycket varierande N-terminal-skal från det huvudsakliga proteinet i kapsiden (region C) med användning av primrar som ursprungligen beskrivits av Kojima et al. 5 visas i detalj. Sekvensering av PCR-produkten från den konventionella PCR möjliggör differentiering av genotyper som hör till GI och Gli genogrupper.Med användning av ekonomiska intern metod för isolering av nukleinsyra från avföringsprover, vi erhålla samma resultat som med kommersiella QIAmp virala RNA-kit från Qiagen, och tillsammans med TaqMan RT-PCR utvecklades i vårt laboratorium har vi kan detektera ett brett spektrum av NOV genotyper som hör till GI och GII gengrupp. En nyligen utkommen publikation av regionen C-protokollet rapporterade genotypning andelen 78% 6. Eftersom mångfald samtida nov stammarna har ökat under tidigare år kommer …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka National Center calicivirus Laboratory for Disease Control and Prevention (CDC) för den typ gåva av en standard och kontroll positiva i nov och laboratorier School of Public Health vid Johns Hopkins för att ge reagensen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |