차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화
Summary
여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.
Abstract
이 비디오는 glial 피더 층, bilaminar 또는 공동 문화 모델로 알려진 시스템의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런의 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이 시스템은 유리 또는 플라스틱의 성장 기판 중 하나를 필요로하는 실험이 필요 다양한하기에 적합하며 뉴런의 다른 유형의 문화도 사용할 수 있습니다.
후반 배아 단계 (E17)에서 얻은 쥐 대뇌 피질의 뉴런은 유리 coverslips 또는 각각 접시 또는 플라스틱 coverslips (Thermanox라고도 함)에 대한 성장 glia의 피더 레이어를 마주 조직 문화 요리에 도금입니다. 두 구성 사이의 선택은 특정 실험 요구할 수 사용 기법, 또는하지에 따라, 그 뉴런이 유리 (예 : 칼슘 이미징 비해 서양 얼룩)에 성장하고 있습니다. glial 피더 레이어 혼합 glia의 astroglia – 풍부한 차 문화, 별도의 연결을하기 전에 신생아 쥐 새끼의 cortices (P2 – 4)에서 준비가되어 있습니다해부.
뉴런의 문화에 비해이 문화 시스템의 가장 큰 장점은의 연결을 성장, 생존, 그리고보다 정확하게 생체내의 뇌는 환경과 유사한 glial 피더 계층에서 분비 영양 요소에서 제공하는 분화의 지원입니다. 또한, 공동 문화의 연결 – glial 상호 작용 1 공부하는 데 사용할 수 있습니다.
동시에,의 연결 레이어에 glia 오염은 다른 설립 방법 1 비교 사실상 순수의 연결 레이어에 이르는 다른 수단 (저밀도 문화, mitotic 억제제의 추가, 최적화된 배지의 혈청 및 사용의 부족)에 의해 차단됩니다 -3. 뉴런은 쉽게 문화 중에 언제든지 glial 계층에서 분리하고 전기 생리학 4 세포와 분자 생물학 5-8, 생화학 5, 이미징 및 마이크에 이르기까지 다양한 실험적인 애플 리케이션에 사용될 수 있습니다roscopy 4,6,7,9,10. 기본 뉴런 일부 세포 라인 프로세스를 확장 할하지만, 기능 시냅스의 연결에게 셀 라인에서 관찰되지 않는 프로세스를 11 형태 axons과 dendrites을 연장.
이 공동 문화 시스템을 사용 culturing 쥐 hippocampal 뉴런의 상세한 프로토콜은 이전에 설명한 4,12,13되었습니다. 여기 세부 대뇌 피질 뉴런에 적합 수정된 프로토콜을. 약 20×10 6 셀 각 쥐의 배아에서 발견한 있으므로,이 방법은 뉴런 (그러나 매우 동질적인 인구의 연결에 대해 우려하지 않음) 많은 숫자가 필요한 실험에 특히 유용합니다. 뉴런과 glia의 준비 시간을 특정 방식으로 계획해야합니다. 우리는 뉴런을 지원하기 위해 단계별 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜뿐만 아니라 culturing glial 세포를 제공할 것입니다.
Protocol
Discussion
뉴런 쉽게 실험 분석을 위해 격리 수 있도록하면서이 프로토콜은, glia 세포의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 기본 방법을 제공합니다. 건강의 연결 표현형의 glia 지원 개발하는 동안 생리학 관련성이 높은 방식으로 실험 트리 트먼트도 modulating의 연결 반응. 또한, 따라서 염증 microglial 자극을 방지하는이 세포 인구가 선택 astrocytes에 농축되는 뉴런과 culturing하기 전에 기본 glia를 passagin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로토콜의 세련되고 년간 지원 NIH (DA19808와 OM에 DA15014)에 기여 이전 실험실 구성원 주셔서 감사합니다. 안나 ABT 1 "neuroAIDS의 학제간 및 Translational 연구 교육"(T32 – MH078795)의 동료이며 따라서이 작품은 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 5T32MH079785에 따라 국립 보건원에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Pesquisa Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Pesquisa |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Pesquisa Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Pesquisa Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Pesquisa Instruments |
11-1395 |
Referências
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