ציטוכרום c אוקסידאז / נתרן דהידרוגנז (COX / SDH) פעמיים תיוג השיטה מאפשרת להדמיה ישירה של המיטוכונדריה אנזים ליקויים בדרכי הנשימה טרי קפוא סעיפים רקמות. זוהי טכניקה פשוטה histochemical שימושי חוקרת מחלות מיטוכונדריאליות, הזדקנות, הזדקנות בהפרעות הקשורות.
דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) ליקויים הם גורם חשוב של המחלה וייתכן ביסוד הזדקנות מהזדקנות 1,2 שינויים. התיאוריה המיטוכונדריה של הזדקנות מציע תפקיד מוטציות mtDNA, אשר יכול לשנות הומאוסטזיס bioenergetics ותפקוד התא, בתהליך ההזדקנות 3. שפע של עדויות כבר מלוקט תמיכה 1,4 זה בתיאוריה, להיות דוגמה המוטטורי mtDNA עכבר 5, אך את התפקיד המדויק של הנזק mtDNA בהזדקנות הוא לא הבין לגמרי 6,7.
התבוננות את הפעילות של אנזימים הנשימה היא גישה פשוטה לחקירת תפקוד המיטוכונדריה. קומפלקס IV, או ציטוכרום אוקסידאז ג (COX), חיוניים לתפקוד המיטוכונדריה. יחידות משנה קטליטי של COX מקודדים על ידי mtDNA חיוניים להרכבה של המתחם (איור 1). לפיכך, סינתזה לתפקוד תקין והם מבוססים במידה רבה על mtDNA שלמות 2.למרות מתחמי נשימתיות אחרות יכול להיחקר, מתחמי IV ו-II הם נוחים ביותר לבחינה histochemical 8,9. קומפלקס II, או דהידרוגנז succinate (SDH), מקודד כולו על ידי ה-DNA גרעיני (איור 1), ואת הפעילות שלה הוא בדרך כלל לא מושפעים לקויי mtDNA, למרות עלייה עשויים להצביע biogenesis המיטוכונדריה 10-12. MtDNA לקויי שנצפתה מחלות מיטוכונדריאליות, ההזדקנות, מחלות הקשורות לגיל מוביל לעתים קרובות נוכחות של תאים עם פעילות COX נמוך או נעדר 2,12-14. למרות פעילות COX ו SDH יכול להיחקר בנפרד, שיטת רציפים פעמיים תיוג 15,16 הוכיח את יתרון באיתור תאים עם תפקוד המיטוכונדריה 12,17-21.
רבים מן החוקות אופטימלי של assay נקבעו, כגון ריכוז המצע, acceptors האלקטרון / תורמים, נושאות אלקטרון ביניים, ההשפעה של ה-pH, ו-t התגובהIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) הוא תורם אלקטרון יעיל ואמין 22. בתאים עם תפקוד COX, המוצר פולימר חום indamine יהיה להתמקם cristae המיטוכונדריה ו להרוות תאים 22. תאים אלה עם COX מתפקדת ולכן לא יהיה רווי ידי DAB המוצר, המאפשר הדמיה של פעילות SDH על ידי הפחתה של nitroblue tetrazolium (NBT), acceptor האלקטרון, למוצר formazan כחול סוף 9,24. ציטוכרום C ו succinate מצעים נתרן מתווספים לנרמל את רמות אנדוגני מלאה בין חולה / מוטציה רקמות 9. Catalase נוסף כאמצעי זהירות, כדי למנוע זיהום אפשרי התגובות מפעילות peroxidase 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), נושאת אלקטרון ביניים, הוא משמש יחד עם אזיד הנתרן, מעכב שרשרת הנשימה, כדי להגביר את היווצרותם של תוצרי התגובה הסופית 9,25. למרות זאת להודיעation, כמה פרטים קריטיים המשפיעים על התוצאה של assay זה פשוט נאה, בנוסף שולטת הספציפיות התקדמות הטכניקה, טרם הציג.
השיטה המשולבת COX / SDH histochemical מאפשרת ויזואליזציה של תאים בעלי תפקוד המיטוכונדריה. טכניקה זו, עם מחקרים מוקדמים שראשיתה 1968, נותר פופולרי, עם הרבה בהתחשב בכך את "תקן הזהב" לזיהוי מחלות מיטוכונדריאליות בחולים 14,19,26,27. עכשיו זה משמש לעתים קרובות כדי לחקור mtDNA מוטצ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG04418), המכון הלאומי לשימוש בסמים, המכון הלאומי לבריאות, קרולינסקה תוכנית Institutet שותפויות בוגר, קרולינסקה Institutet, שוודית מועצת המחקר, כוח המוח שוודית, קרן המוח שוודית. תודות רבות Mattias קרלן, ד"ר ג'וזפה Coppotelli לתמיכה יצירתי עם איור 1 ו – 2, בהתאמה; קארין Pernold לקבלת סיוע טכני; ואת בני הזוג. בארי ג'יי הופר, לארס אולסון, נילס, גוראן לארסון עבור עצות מועילות דיון רב.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
Entellan | VWR International | 100503-870 | |
Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |