Visualisering av mitokondrie lungfunktion med hjälp av cytokrom C Oxidas / succinatdehydrogenas (COX / SDH) Dubbelklicka märkning Histochemistry
Summary
Cytokrom c oxidas / natrium dehydrogenas (COX / SDH) dubbel-märkning metoden möjliggör direkt visualisering av mitokondrie respiratoriska enzym brister i söt-frysta vävnadssnitt. Detta är en rättfram histokemiska teknik och är användbar för att utreda mitokondriella sjukdomar, åldrande och åldersrelaterade sjukdomar.
Abstract
Mitokondrie-DNA (mtDNA) defekter är en viktig orsak till sjukdom och kan ligga bakom åldrande och åldersrelaterade förändringar 1,2. Den mitokondriella teori om åldrandet antyder en roll för mtDNA mutationer, som kan förändra bioenergetik homeostas och cellulära funktion i åldrandeprocessen 3. En mängd bevis har sammanställts till stöd för denna teori 1,4, ett exempel är mtDNA Mutator musen 5, men det är den exakta rollen av mtDNA skador i åldrande inte helt förstått 6,7.
Observation av aktiviteten av andningsskydd enzymer är en enkel metod för att undersöka mitokondriell dysfunktion. Komplexa IV eller cytokrom c oxidas (COX), är viktigt för mitokondriell funktion. Den katalytiska subenheter av COX kodas av mtDNA och är avgörande för montering av komplexa (Figur 1). Således är korrekt syntes och funktion stor del baserat på mtDNA integritet 2.Även andra respiratoriska komplex kunde undersökas, komplex IV och II är de mest mottagliga för histokemiska undersökningen 8,9. Komplexa II, eller succinatdehydrogenas (SDH), är helt kodas av kärn-DNA (figur 1) och dess verksamhet är normalt inte påverkas av nedsatt mtDNA, men en ökning kan tyda på mitokondriell biogenes 10-12. Den försämrad mtDNA observerats i mitokondriella sjukdomar, åldrande och åldersrelaterade sjukdomar leder ofta till förekomsten av celler med låg eller obefintlig COX aktivitet 2,12-14. Även COX-och SDH-aktiviteter kan undersökas individuellt, har sekventiell dubbel märkning metod 15,16 visat sig vara fördelaktigt att lokalisera celler med mitokondriell dysfunktion 12,17-21.
Många av de bästa konstitutioner analysen har fastställts, såsom substrat koncentration, elektron acceptanter / givare, mellan elektron bärare, påverkan av pH, och t reaktionIME 9,22,23. 3,3 '-Diaminobenzidin (DAB) är ett effektivt och tillförlitligt elektron donator 22. I celler med fungerande COX, kommer den bruna indamine polymera produktsystem lokalisera i mitokondriernas cristae och mätta celler 22. Dessa celler med dysfunktionella COX kommer därför inte att mättat av DAB-produkt, vilket möjliggör visualisering av SDH aktivitet genom reduktion av nitroblue tetrazolium (NBT), en elektronacceptor, en blå formazanförening slutprodukt 9,24. Cytokrom c och natrium substrat succinat läggs för att normalisera endogena nivåer mellan kontroll och sjuk / mutant vävnader 9. Katalas läggs till som en försiktighetsåtgärd för att undvika eventuella kontaminerande reaktioner från peroxidasaktivitet 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), en intermediär elektron bärare, används tillsammans med natriumazid, en andningskedjan hämmare, för att öka bildandet av den slutliga reaktionen 9,25. Trots detta informeraring, några kritiska detaljer som påverkar resultatet av denna passande enkla analys utöver specificitet kontroller och framsteg inom teknik, ännu inte har presenterats.
Protocol
Discussion
Den kombinerade COX / SDH histokemiska metod gör att den visualisering av celler med mitokondriell dysfunktion. Denna teknik, med tidiga studier som går tillbaka till 1968, är fortfarande populär, med många med tanke på den "gyllene standarden" för att identifiera mitokondriella sjukdomar hos patienter 14,19,26,27. Det är nu ofta används för att undersöka mtDNA mutation driven åldrande och åldersrelaterade sjukdomar 12,13,18,20,21,24. COX / SDH dubbel-märkning metoden använ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health, Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, svenska Vetenskapsrådet, svenska Brain Power, och svenska Hjärnfonden. Många tack till Mattias Karlén och Dr Giuseppe Coppotelli för kreativa stöd med figur 1 respektive 2, Karin Pernold för tekniskt bistånd, och Dr. Barry J. Hoffer, Lars Olson och Nils-Göran Larsson för mycket goda råd och diskussion.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
Referências
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
