Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica
Summary
Il citocromo c ossidasi / sodio deidrogenasi (COX / SDH) doppio metodo di etichettatura permette di visualizzare direttamente mitocondriale deficit enzimatici respiratori nei fresco congelato sezioni di tessuto. Questa è una tecnica semplice istochimiche ed è utile nelle indagini malattie mitocondriali, invecchiamento e patologie legate all'invecchiamento.
Abstract
DNA mitocondriale (mtDNA) difetti sono una causa importante di malattia e può essere alla base dell'invecchiamento e all'invecchiamento 1,2 alterazioni. La teoria mitocondriale dell'invecchiamento suggerisce un ruolo per le mutazioni del mtDNA, che possono alterare l'omeostasi bioenergetica e la funzione cellulare, nel processo di invecchiamento 3. Una ricchezza di prove è stato redatto a sostegno di questa teoria 1,4, un esempio è il mtDNA mutator mouse 5, tuttavia, il ruolo preciso dei danni del DNA mitocondriale nell'invecchiamento non è del tutto compreso 6,7.
Osservando l'attività degli enzimi respiratori è un approccio semplice per lo studio disfunzione mitocondriale. Complesso IV o citocromo c ossidasi (COX), è essenziale per la funzione mitocondriale. La subunità catalitica del COX sono codificati da mtDNA e sono essenziali per l'assemblaggio del complesso (Figura 1). Così, la sintesi corretta e la funzione sono in gran parte sulla base di mtDNA integrità 2.Anche se altri complessi respiratori potrebbero essere indagati, Complessi IV e II sono i più suscettibili di esame istochimico 8,9. Complesso II, o succinato deidrogenasi (SDH), è interamente codificato dal DNA nucleare (Figura 1), e la sua attività non è in genere affetti da compromissione del mtDNA, anche se un aumento potrebbe indicare la biogenesi mitocondriale 10-12. Il mtDNA alterato osservati in malattie mitocondriali, invecchiamento e malattie legate all'età conduce spesso alla presenza di cellule con scarsa o assente attività COX 2,12-14. Anche se le attività COX e SDH possono essere analizzati individualmente, il sequenziale a doppia etichettatura 15,16 metodo ha dimostrato di essere vantaggioso per localizzare le cellule con disfunzione mitocondriale 12,17-21.
Molte delle costituzioni ottimale del test sono stati determinati, come la concentrazione del substrato, accettori di elettroni / donatori, intermedio trasportatori di elettroni, l'influenza del pH, e t reazioneime 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) è un donatore di elettroni efficace ed affidabile 22. Nelle cellule con il funzionamento della COX, il marrone indamine polimero prodotto sarà localizzare in creste mitocondriali e saturare le cellule 22. Queste cellule disfunzionali con COX quindi non sarà saturata dal prodotto DAB, consentendo la visualizzazione di attività SDH con la riduzione del tetrazolio (NBT), accettore di elettroni, di un blu prodotto finale formazan 9,24. Citocromo c e substrati succinato di sodio vengono aggiunte per normalizzare i livelli endogeni tra controllo e malati / mutante tessuti 9. Catalasi viene aggiunto come precauzione per evitare possibili reazioni contaminazione da attività di perossidasi 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), un vettore intermedio di elettroni, viene utilizzato in combinazione con sodio azide, un inibitore della catena respiratoria, per aumentare la formazione di prodotti di reazione finale di 9,25. Nonostante questo informarezione, alcuni dettagli fondamentali che influenzano il risultato di questo test conveniente semplice, in aggiunta ai controlli specificità e avanzamenti nella tecnica, non sono ancora stati presentati.
Protocol
Discussion
Il combinato COX / SDH metodo istochimico permette la visualizzazione di cellule con disfunzione mitocondriale. Questa tecnica, con i primi studi risalgono al 1968, resta popolare, con molti considerato il "gold standard" per identificare le malattie mitocondriali nei pazienti 14,19,26,27. Ora è spesso utilizzato per indagare mutazioni del mtDNA-driven invecchiamento e patologie legate all'invecchiamento 12,13,18,20,21,24. La COX / SDH a doppia etichettatura metodo viene spesso utili…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health, Karolinska Institutet Programma Graduate Partnership, Karolinska Institutet, Consiglio svedese della ricerca, Brain Power svedese, e Brain Foundation svedese. Molte grazie a Mattias Karlen e il Dr. Giuseppe Coppotelli per il supporto creativo di figura 1 e 2, rispettivamente; Karin Pernold di assistenza tecnica; e Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson, e Nils-Göran Larsson per molti consigli utili e di discussione.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
Referências
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