लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति
Summary
हम pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं छोटे अणु है, जो मानव हृदय के लिए हृदय की मरम्मत progenitors और कार्यात्मक cardiomyocytes की एक बड़ी आपूर्ति की व्युत्पत्ति के लिए सक्षम बनाता है के साथ परिभाषित शर्तों के तहत बनाए रखा से सीधे cardioblasts के शामिल होने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है.
Abstract
To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.
Protocol
Discussion
दोनों विकासात्मक अध्ययन और नैदानिक अनुवाद के लिए प्रमुख चुनौतियों में से किया गया है कि कैसे एक वांछित phenotype pluripotent मानव स्टेम कोशिकाओं के व्यापक भेदभाव संभावित चैनल के लिए कुशलतापूर्वक और जाहिर है. हालांकि ऐसी कोशिकाओं इन विट्रो में अनायास सभी रोगाणु परतों की कोशिकाओं में एक बहु – वंश कुल मंच के माध्यम से जा रहा द्वारा अंतर कर सकते हैं, hESC व्युत्पन्न अनायास बहु – वंश (embryoid निकायों) समुच्चय, केवल कक्षों की एक बहुत छोटा अंश (<2%) 13-15 cardiomyocytes (छवि 1A) में अंतर. निम्नलिखित immunoselection, cardiomyocytes की समृद्ध आबादी जैविक पेसमेकर समारोह के रूप में 13 पशु मॉडल के दिल में इंजेक्शन के बाद एक क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम के समारोह यंत्रवत् और इलेक्ट्रॉनिक बचाव करने में सक्षम थे. कृंतक infarcted मॉडल में, engrafted व्युत्पन्न है – hESC हृदय progenies के लिए जीवित है और 12 सप्ताह के लिए परिपक्व करने में सक्षम थे, और आंशिक रूप से remuscularघायल दिल ize और सिकुड़ा 14,15 समारोह में सुधार . हालांकि, pluripotent कोशिकाओं की बहु वंश भेदभाव और tumorigenicity निम्नलिखित प्रत्यारोपण के उच्च जोखिम के माध्यम से मानव हृदय प्रतिबद्ध कोशिकाओं पैदा करने में अक्षमता आगे नैदानिक अनुवाद रुकावट है. रणनीतियों का विकास एक हृदय phenotype pluripotent hESCs की व्यापक भेदभाव की क्षमता विशेष रूप से और जाहिर चैनल हृदय क्षेत्र में hESC जीव विज्ञान की शक्ति का दोहन करने के लिए महत्वपूर्ण है. आदेश में एक विशेष वंश मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के समान रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, हम एक परिभाषित संस्कृति undifferentiated hESCs के प्रसार insuring एक विशेष नैदानिक प्रासंगिक वंश के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से नियंत्रित pluripotent hESCs के कुशल शामिल होने के लिए शर्तों की पहचान करने में सक्षम प्रणाली कार्यरत छोटे अणुओं के सरल प्रावधान (चित्र 1 बी) के द्वारा . हमने पाया कि nicotinamide प्रेरित पी से सीधे हृदय वंश प्रतिबद्धतापरिभाषित संस्कृति के तहत luripotent hESCs है कि आगे के लिए उच्च दक्षता (छवि 2) के साथ पिटाई cardiomyocytes प्रगति. Nkx2.5 एक evolutionally संरक्षित homeobox प्रतिलेखन कारक सामान्य हृदय के विकास और जीन परिवर्तन के लिए अपरिहार्य है मानव जन्मजात हृदय रोग (CHD), मानव जन्म 16 सबसे आम दोष के साथ जुड़े हैं . Nkx2.5 की अभिव्यक्ति दिल अग्रदूत साबित कोशिकाओं के लिए सभी अब तक की जांच की रीढ़ में जल्द से जल्द मार्कर है और उचित हृदय दो भागों में विभाजित और गठन / विद्युत प्रवाहकत्त्व 16 प्रणाली की परिपक्वता के लिए आवश्यक है. रीढ़ में, और जल्दी Nkx2.5 अभिव्यक्ति की शुरुआत पैटर्न लगभग समय और जल्दी embryogenesis में हृदय विनिर्देशन के क्षेत्र के साथ मेल खाना, और Nkx2.5 जीन 16 दिल में विकास के माध्यम से व्यक्त किया जा रहा है. हमारे hESC मॉडल में गुटनिरपेक्ष आंदोलन हृदय विशेष transcri की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के द्वारा pluripotent hESCs से हृदय प्रत्यक्ष प्रेरण ट्रिगर दिखाईption एक प्रक्रिया है कि मानव भ्रूण कार्डियोजेनेसिस में pluripotent आद्यबहिर्जनस्तर से cardiomesoderm के विनिर्देशन का अनुकरण सकता है में कारक Nkx2.5. भविष्य के अध्ययन के विकल्प के रूप में मानव हृदय के विकास में आनुवंशिक और epigenetic नियंत्रण अणुओं, प्रकट होगा जो छोटे अणु की मध्यस्थता प्रत्यक्ष और hESC pluripotent भाग्य के नियंत्रण मॉडुलन के लिए मार्ग प्रशस्त जब पुनर्योजी उपचार के लिए नैदानिक प्रासंगिक प्रजातियों पाने सकता है. गुटनिरपेक्ष आंदोलन उपचार के बिना, <2% hESCs 12-15 cardiomyocytes की धड़कन में सहज भेदभाव से गुजरना होगा. गुटनिरपेक्ष आंदोलन के उपचार के साथ, हम 95>% भ्रूण हृदय एक प्रक्रिया है कि मानव भ्रूण दिल विकास 12 का अनुकरण सकता है में एक संस्कृति को परिभाषित के तहत बनाए रखा hESCs से व्यापारियों और> 50% पिटाई cardiomyocytes उत्पन्न करने में सक्षम किया गया है. हाल ही में, जाना जाता भाग्य हृदय निर्धारण जीन <0.5 17%, 18 के एक कम क्षमता के साथ प्रसवोत्तर पिटाई cardiomyocytes में माउस fibroblasts transdifferentiate इस्तेमाल किया गया है </> समर्थन. हालांकि, reprogrammed दैहिक कोशिकाओं ऐतिहासिक असामान्य जीन अभिव्यक्ति और बिगड़ा चिकित्सीय उपयोगिता 19-21 के साथ त्वरित senescence के साथ संबद्ध किया गया है है. अंत में, हम यहाँ स्थापित प्रोटोकॉल pluripotent भीतर सेल (ICM) जन या मानव 4,5 ब्लास्टोसिस्ट की आद्यबहिर्जनस्तर से प्राप्त hESCs के लिए सीमित है, पशु उत्पन्न ESCs, पहले morula से व्युत्पन्न ESCs सहित अन्य pluripotent कोशिकाओं, के लिए लागू नहीं हो सकता (आठ सेल) चरण 22 भ्रूण, और कृत्रिम reprogrammed कोशिकाओं 23.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XHP से एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान (NIHK01AG024496) और Eunice कैनेडी बाल स्वास्थ्य और मानव विकास की श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट (NIHR21HD056530) स्वास्थ्य (NIH) के अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma | L6274 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
Referências
- Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
- Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
- J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
- Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
- Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
- Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
- Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
- Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O’Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
- Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
- Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
- Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
- Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
- Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
- Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
- Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
