Ice-Cap: En metode til Voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønds plader for High-Throughput genotypebestemmes

Summary

The Ice-Cap metode tillader en at dyrke planter i 96-brønds plader og ikke-destruktivt høst roden væv fra hver frøplante. DNA ekstraheret fra denne rod væv kan bruges til genotypebestemmelse reaktioner. Vi har konstateret, at Ice-Cap virker godt for<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomat og ris frøplanter.

Abstract

Det er ved at blive almindeligt, at anlægget forskere til at udvikle projekter, der kræver genotypebestemmelse af et stort antal planter. Det første trin i enhver genotypebestemmelse projektet er at indsamle en vævsprøve fra den enkelte plante. Den traditionelle tilgang til denne opgave er at prøve planter one-på-en-time. Hvis man ønsker at genotype hundredvis eller tusindvis af individer, men at bruge denne strategi resulterer i en betydelig flaskehals i genotypebestemmelse pipeline. The Ice-Cap metode, som vi beskriver her, giver en high-throughput løsning på denne udfordring ved at lade en forsker til at indsamle væv fra flere tusinde planter på en enkelt dag ^1,2. Dette niveau af gennemløb er muliggjort af, at vævet er høstet fra planter 96-i-en-tid, snarere end en-til-en-time.

The Ice-Cap-metoden giver en integreret platform til at udføre sætteplante vækst, væv høst, og dna-ekstraktion. Grundlaget for Ice-Cap er væksten i seedliNGS i et stablet par 96-brønds plader. Brøndene af den øverste plade indeholder stik agar vækst medier, som de enkelte frøplanter spire. Rødderne vokser ned gennem agarmedier, den øverste plade ud gennem et hul, og bestå i en lavere plade, som indeholder vand. At høste væv til dna-ekstraktion, vandet i den nederste plade, der indeholder rod væv er hastigt fastfrosset, mens de planter i den øverste plade forblive ved stuetemperatur. Den øverste plade er så skrællet væk fra den nederste plade, hvoraf en plade med 96 roden vævsprøver nedfrosset i is og en plade med 96 levedygtige kimplanter. Teknikken hedder "Ice-Cap", fordi det bruger is til at indfange de dybereliggende væv. Den 96-brønds plade, som indeholder de planter kan derefter pakket ind i folie og overføres til lav temperatur. Denne proces suspenderer yderligere vækst af planter, men ikke påvirke deres levedygtighed. Når genotype analyse er afsluttet, kan frøplanter med den ønskede genotype skal overføres fra den 96-godt psent til jord til yderligere udbredelse. Vi har vist nytten af Ice-Cap-metoden ved hjælp af Arabidopsis thaliana, tomat og ris frøplanter. Vi forventer, at metoden også bør gælde for andre arter af planter med frø lille nok til at passe ind i brønde af 96-brønds plader.

Protocol

1. Forbered Ice-Cap Kimplante Plader med Agar vækstmedie Smeltet vækstmedier (0,5 x Murashige og Skoog (MS) basal salt blanding, 2 mm Morpholinoethanesulfonic syre (MES), 0,6% agar (w / v), pH 5,7) fordeles i autoklaveres Kimplante Plader med en MicroFill Mikropladekrav dispenser. En liter medier er nødvendige pr 18 Kimplante plader. Forbered vækst medier på én liter glasflasker med skruelåg låg og autoklaveres i 20 minutter. Autoklave en liter destilleret vand i en glasflaske med skruelåg låg. Samtidig er også autoklave tom Kimplante Plader indpakket i aluminiumsfolie. Overfør autoklaveres medier og vand til en inkubator på 65 ° C. Denne temperatur vil fastholde væksten medierne i en smeltet tilstand. Efter autoklavering, fjerne Kimplante Plader fra folie og plads i laminar flow hætte til at tørre. Plader skal være helt tørt, før du fortsætter, så den klæbende pakning tape kanhelt forsegle huller i bunden af ​​brøndene af pladerne. Tør ned laboratoriearbejdet med 95% ethanol til sanitize. Soak klar plast låg for Seedling plader i 95% ethanol til sanitize. Fjern låget fra ethanol og lufttørre i laminar flow hætte. Må ikke autoklaveres plastik låg til at sterilisere dem, fordi de vil smelte i autoklaven. Anvend tape i bunden af ​​hver Seedling Plate og fast segl ved hjælp af valsen værktøj. Placer flasker af smeltet vækst medier og steriliseret vand i vandbad indstillet til 65 ° C. Vedhæft en flaske indeholdende 70% ethanol ved stuetemperatur til MicroFill maskinen og køre udrensning cyklus to gange for at rense VVS af MicroFill maskinen. Fastgør flaske med sterilt vand til MicroFill maskinen. Kør udrensning cyklus seks gange for at opvarme VVS og rydde ethanol ud af systemet. Den flaske vand bør forblive i 65 ° C bad hele den nævnte fremgangsmåde. Efter endt udrensningerne med sterilt vand, lægger straks flasken med smeltet vækstmedier til MicroFill maskinen. Kør udrensning cyklus to gange for at rydde destilleret vand ud af VVS. Den flaske vækstmedier bør forblive i 65 ° C bad under hele denne procedure. Dispensér 450 mikroliter af vækst medier i brøndene af hver Seedling Plate. Arbejde hurtigt, således at væksten medierne ikke størkne i VVS af MicroFill maskinen. Når alle de Seedling Plates er blevet fyldt, umiddelbart lægger flasken på 65 ° C sterilt vand til MicroFill maskinen og køre udrensning cyklus 12 gange for at rense VVS. Den flaske vand bør forblive i 65 ° C bad under hele denne procedure. Hvis en MicroFill maskine ikke er tilgængelig, kan Kimplante Plader også skal udarbejdes af hånd-pipettering smeltede agar i de forseglede plader ved hjælp af en multikanal pipette. Undersøg brønde hver Seedling Platter to sikre, at væksten medierne ikke er sivet ud af enhver brønde. Hand pipette yderligere smeltet vækstmedie i de enkelte brønde efter behov. Dæk hver tallerken med en klar plast låg, og lad vækstmedie at størkne i Seedling Plader ved stuetemperatur. Stak plader og wrap i aluminium folie til opbevaring ved 4 ° C. Store plader på hovedet ned for at forhindre vand ophobning i brøndene under opbevaring. 2. Soen Frø til Ice-Cap Kimplante Plader og spirer stiklinger Vi har tidligere beskrevet en semi-automatiseret metode til dispensering Arabidopsis frø i Kimplante plader ved hjælp af et frø loading-enhed (2). Selv om denne enhed kan være nyttigt for nogle partier af frø, har vi fundet, at den variation i frø størrelse, der vises af forskellige partier af arabidopsis frø begrænser generel anvendelighed af denne enhed. Vi er i færd med at udvikle en alternativ automatiseret metode til frø dispensering, but på nuværende tidspunkt har vi fundet, at den mest effektive strategi til dispensering frø i Seedling Plates er at udføre dette trin i hånden som beskrevet nedenfor. Drys tørre frø på Whatman-filtrerpapir. Dispensér 95% ethanol på frø, så alle frøene er dækket med ethanol. Denne behandling vil overfladen sterilisere frøene. Lad frø lufttørre. Overfør de enkelte frø ind i brønde på Seedling Platter hjælp af en modificeret engangs glas Pasteur pipette. Den ende af Pasteur-pipette er forseglet af flammende spidsen. Den resulterende glas tip er fugtet ved forsigtigt at røre på agar medier, som tillader en enkelt frø, der let samles op og overføres til overfladen af ​​agar i brøndene af Seedling Plate. En dobbelt-ledet version af dette frø plating værktøj kan også bruges til at øge gennemløb. Cover hver Kimplante plade med en klar plast låg og tætning med Micropore kirurgisk tape. Wrap de stablede pladermed aluminiumfolie og opbevares Arabidopsis frø ved 4 ° C i fire dage for at stratificere frøene og synkronisere spiring. Tomat frø skal opbevares i mørke ved 12 ° C i fire dage. Placer Kimplante plader under fluorescerende lys ved 18 ° til 20 ° C for at indlede spiringen. 3. Overførsel Kimplante Plader til Ice-Cap Fountain Efter Kimplante plader har været under lys i fire dage, overføre Seedling plader til Ice-Cap springvand. For Arabidopsis, er frøplanter typisk venstre i Ice Cap springvand i 10 til 14 dage. Saml Ice-Cap-fontænen ved at placere en cookie ark oven på den brugerdefinerede rack struktur, som er placeret inde i en plastik opbevaringskasse. Brug nivellering nødder at justere niveauet af bagepapir. Placer en dykpumpe i opbevaringsboks og vedhæft output slangen fra pumpen til den side af bagepapir ved hjælp af en fjederbelastet CLAmp. Saml Ice-Cap-fontænen på en hylde i planternes vækst rummet eller vækst kammer, så overfladen af ​​Ice-Cap Fountain modtager direkte fluorescerende belysning. Fyld Ice-Cap-fontænen med en blanding af 3 dele destilleret vand til 1 del vand fra hanen. Vand bør føjes til springvandet, indtil dykpumpe er flere centimeter under vandoverfladen. Marker den endelige vandstanden i plastik opbevaringsboks med lab tape og en markeringspen. Forbered Root Plader ved at tilføje en 3/32-inch diameter rustfrit stål bolden til hver brønd i en Root Plate. Den rustfrie stålkugler kan tilføjes til Root plader ved hjælp af et skræddersyet bold udlevering enhed 1. Denne enhed er lavet ved at placere et enkelt ark af aluminiumsfolie over overfladen af ​​en 96-brønds PCR-plade og bruge en markeringspen at markere de steder af centrene for hver brønd på overfladen af ​​folien. Dette markerede ark folie er derefter placeret på toppen af ​​yderligere 6 plader af aluminium tilil og snoet omkring den glatte overflade af et låg fra en brugt pipettespidsen boks. En skarp værktøj som en træ spyd er derefter bruges til at skabe et hul stort nok til at rumme en enkelt metal kugle på hver af de 96 positioner. For at udfylde dette dispensering enhed med bolde, er et overskud af metalkugler hældes over enheden og den er forsigtigt rystes for at fjerne overskydende bolde. Den Root Plate er derefter placeret over toppen af ​​udlevering enhed, som er vendt i løbet at droppe en bold ind i hvert hul i Root Plate. Tilsæt 340 mikroliter af en blanding af 3 dele destilleret vand til 1 del vand fra hanen til hvert hul i Root Plate bruger MicroFill maskinen. Sørg for, at stålkugler er blevet føjet til Root plader før udlevering vandet. Skræl den selvklæbende film væk fra bunden af ​​de Seedling Plader og fjerne det gennemsigtige plastik låg fra pladerne. Sted hvert Kimplante pladen i et Root Plate, der indeholder en metalkugle og vand og sikre de to plader sammen ved hjælp af to elastiske hair bands. Placer stablet Ice-Cap plader i Ice-Cap-fontænen. Den klare plastik dæksler bør ikke anvendes, når pladerne er i Ice-Cap-fontænen. Kontrollér, at såvel A-01 af Seedling Plate er justeret med såvel A-01 af Root Plate. Den stablede Kimplante / Root Plader bør overlades i Ice-Cap-fontænen, indtil de fleste af de planter har rod væv, der er trængt ind i Root plader. Den ideelle vækst i temperatur for Arabidopsis frøplanter i Ice-Cap-fontænen er ca. 18 ° C. Vandstanden i bagepapir bør være sådan, at vand kan strømme ind i brønde på Root plader, men ikke så dyb, at de planter i Seedling Plate er neddykket. Hvis vandstanden ikke er korrekt, du bliver nødt til at få en anden cookie ark i den korrekte dybde. Tilsæt destilleret vand regelmæssigt til Ice-Cap Fountain at fastholde den oprindelige vandstand. Ved at tilføje rent destilleret vand til springvandet, du vil erstatte devæske tabt på grund af fordampning uden at ændre den mineralske sammensætning af vandet i springvandet. Vandstanden bør kontrolleres dagligt i Ice-Cap Fountain. 4. Harvest Root Tissue Root væv er høstet ved frysning af vand i roden Plate og derefter peeling af Seedling Plate væk fra roden Plate. Dagen før høsten rod væv, fjerne de stablede Ice-Cap Plader fra Ice-Cap-fontænen. Indsætte tre træspyd mellem brønde af stablede Seedling og Root plader. Formålet med spyddene er at øge de nationale gennemførelsesorganer af Seedling Plader ud af brøndene af Root Plader som forberedelse til indefrysning processen. Lad stablet Ice-Cap Plader med træspyd indsat til at stå natten over under lys. Dette inkubering tillader let fordampning af væsken i roden plader, som letter den efterfølgende frysning og plade separationsprocesser. Ondagen af ​​væv høst, forberede en indefrysning bad. Placer en 96-brønds metal termisk blok i et Pyrex fad med blanding af tøris og 95% ethanol. Lad den termiske blok til ligevægt i temperaturen til ca. 20 minutter. Placer Pyrex fad oven på nogle typer af isolerende materiale, såsom en autoklave vanten, så den lave temperatur ikke skader overfladen på laboratoriearbejdet. Placer stablet Ice-Cap plader med træspyd ind i kølede termiske blokken og inkuber i 5 minutter. I denne tid vandet i Root Plate vil fryse fast. Den frøplanter i Seedling Plate ikke fryse under denne behandling, og forbliver fuldt levedygtige. Fjern de stablede Ice-Cap plader fra de termiske blokken og placere dem på laboratoriet bænken ved stuetemperatur. Fjern den elastiske bånd og træspyd fra de stablede plader. Fast trykke ned på toppen af ​​Seedling Plate til at "knække" pladerne. Derefter forsigtigt skræl Root Plate og Seedling Plate APkunst. Lad vandet i Root Plates tø op ved stuetemperatur. Optøning kan fremskyndes ved at inkubere Root Plader i en termisk blok sat til 25 ° C. 5. Store Kimplante Plate ved lav temperatur in the Dark Efter væv høst, kan sætteplante pladerne opbevares i mørke ved lav temperatur, som vil opretholde levedygtigheden af ​​de planter, mens genotype analysen udføres. De frøplanter kan opbevares ved disse temperaturer i flere uger uden at påvirke levedygtighed. Efter væv høst, forsegle den nederste del af sætteplante pladen med den selvklæbende tape. Placer en klar plast låg på toppen af ​​Seedling Plate og sikkert med Micropore tape. Stak flere Kimplante pladerne sammen og pak i alufolie. For Arabidopsis planter, placere pladerne ved 4 ° C. For tomat planter, placere pladerne ved 12 ° C. Når genotypebestemmelse er færdig, seedlings kan fjernes fra denne lave temperatur inkubering og transplanteres til jord som beskrevet nedenfor. 6. DNA Ekstraktion DNA er egnet til PCR reaktioner kan der let kan udskilles fra roden vævsprøver. Udbyttet af det samlede DNA inddrives fra Arabidopsis rod vævsprøver er ca. 400 ng gennemsnitligt 2. Sørg for, at vandet i Root Plates er helt optøet, før du udfører DNA-ekstraktion procedure. Undersøg pladerne for at afgøre, om eventuelle brønde har væsentligt mindre vand end gennemsnittet. Hand pipette destilleret vand i boringer, der kræver ekstra vand. Brug MicroFill maskinen tilsættes 25 mikroliter af en Tris-EDTA-opløsning (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH8) til hvert hul i Root plader. Seal brøndene af Root Platter hjælp termisk forsegling folie og en varme forsegling maskine. Anbring den forseglede roden pladerne på GenoGrinder maskinen medforseglede ende af pladerne nedad. Denne plade orientering giver optimal perle bevægelse og forhindrer perler fra stikning i brøndene. Ryst plader i GenoGrinder i 3 ½ minut ved 1350 slag per minut. Overførsel pladerne til en centrifuge med mikroplade luftfartsselskaber og spin pladerne i 10 minutter ved 3500 RPM ved 4 ° C til pellet den pulveriserede rod væv. Den resulterende fortyndet ekstrakt indeholder genomisk DNA, der kan anvendes direkte i PCR reaktioner. Typisk vil man tilføje 2 mikroliter af denne dna-ekstrakt til en PCR-reaktion. Til opbevaring af DNA-prøver, forsegle mikropladen med selvklæbende tape og sted ved minus 20 ° C. DNA-prøver kan opbevares i flere måneder uden nogen tilsyneladende reduktion i kvaliteten. 7. Overførsel Frøplanter med Ønsket Genotype til jord Når genotype analysen er færdig, kan frøplanter med den ønskede genotype skal overføres fra den SeedlingPlader til jord. Fjern Kimplante Plader fra kølelager og forberede krukker med vand-mættet jord blanding. Hvis du vil fjerne en individuel sætteplante fra Seedling Plate, bruge en pincet, der tillader en at fange den agar stik uden at knuse den sætteplante. Grab agar stik med pincet og forsigtigt skubbe agar stikket ud af Seedling Plate være omhyggelig med ikke at beskadige sætteplante. Alternativt kan trykluft bruges til at forsigtigt skyde agar stik og sætteplante op af brønden. Lægge pres på det lille hul i bunden af ​​brønden, indtil stikket springer ud på laboratoriearbejdet. Forbered et lille hul i jorden størrelsen af ​​agar stik. Placer agar stik i jorden og pakke fugtig jord omkring agar stik for at sikre sætteplante i jorden. Forsøg ikke at fjerne nogen af ​​de agar fra hele sætteplante. Placer transplanterede frøplanter i en vækst rum under normale vækstbetingelser. Dæk potten med en plastik låg tilførste to dage efter transplantationen. Efterfølgende Fjern låget og fortsætte med at dyrke planter ved hjælp af standard betingelser. 8. Repræsentative resultater: Et eksempel på arabidopsis kimplanter dyrket ved hjælp af Ice-Cap-system er vist i figur 4A. Disse frøplanter havde været i Ice-Cap springvand i to uger, da billedet blev taget, og var klar til væv høst. Root væv fra disse samme sætteplante er vist i figur 4B. Den samlede mængde af DNA ekstraheret fra en prøve af arabidopsis rod væv er typisk i størrelsesordenen 100 ng til 700 ng 2. Dette afkast Beregningen er baseret på brug af kun én del af den rå rod ekstrakt. Da der kun ca. 10% af den rå rod ekstrakt er typisk bruges til dna-ekstraktion proces, er det muligt at opnå betydeligt mere genomisk DNA for downstream-analyse ved at beholde flere af de rå ekstrakt. Den samlede mængde af genomisk DNA er opnået med Ice-Cap procedure er tilstrækkelig til at udføre hundredvis af PCR-reaktioner 2. Figur 1: Diagram af Ice-Cap proces. A) Kimplante Plate indeholder agar vækstmedie, som frøplanter spire. Rødder trænge ind i agar og vokse ned mod bunden af ​​pladen. Huller i bunden af ​​brøndene af pladen er forseglet med selvklæbende film. B) Kimplante Plate er stablet oven på en rod Plate indeholder vand og en metalkugle. Rødder forlade huller i bunden af ​​brøndene af Seedling Plate og vokse ind i brøndene af Root Plate. C) træspyd indsættes mellem Seedling Plate og Root Plate dagen før de stablede Ice Cap plader er placeret i en Thermoblock i et tøris / ethanol bad. D) Når vandet i roden Plate er frosset fast, er det Seedling Plate skrællet væk fra roden Plate, hvilket giver en Root Plade med 96 vævsprøverog en Kimplante Plate med 96 levedygtige kimplanter. Den træspyd lette adskillelsen af ​​de to plader i løbet af dette trin. Figur 2: Fotografier af en Seedling Plate og en Root Plate. A) En Kimplante Plate og en Root Plate betragtes adskilt. B) En Kimplante Plate stablet oven på en rod Plate. Stålet bolde, der anvendes til DNA-ekstraktion kan ses i brøndene af Root Plate. Elastikbånd bruges til at sikre de to plader sammen. Figur 3: The Ice-Cap-fontænen. The Ice-Cap Fountain bruges til at opretholde en konstant vandstand på præcise højde toppen af ​​brønde i Root plader. Denne kontinuerlige vandingssystem sikrer, at vandet i brøndene af roden pladerne ikke bliver udtømt på grund af fordampning og transpiration. A) En hjemmelavet rackder understøtter bagepapir, som de stablede Ice-Cap plader sidde. B) Et nærbillede af en af ​​de 1 "nødder, der giver et middel til at justere niveauet for bagepapir, således at en ensartet vanddybde opnås hen over overfladen af ​​springvandet. C): Dette billede viser alle de dele er nødvendige for at konstruere den hjemmelavede rack til en Ice-Cap-fontænen. D) De forsamlede Ice-Cap-fontænen. et undervandsfartøj springvand pumpe konstant flytter vand fra den nedre reservoir til bagepapir, som hviler på toppen af ​​den hjemmelavede rack. En fjederbelastet klemme bruges til at fastgøre slangen til kanten af ​​bagepapir. Figur 4: Arabidopsis planter dyrket ved hjælp af Ice-Cap proces. A) Set ovenfra ser ned i to brønde på en Seedling Plate. Hver brønd indeholder en Arabidopsis sætteplante. B) set fra siden af ​​to brønde på en Root Plate. Rødder kan ses vrideomkring den indvendige overflade af brøndene. De frøplanter i dette billede havde været i Ice-Cap-fontænen til ca. to uger, og er i vækst fase, hvor væv høst normalt ville blive udført.

Discussion

The Ice-Cap-metoden præsenteres her sætter en videnskabsmand til at indsamle vævsprøver fra hundredvis eller endda tusindvis, af individuelle planter i en enkelt dag og effektivt ekstrakt genomisk DNA fra disse prøver til brug i genotypebestemmelse reaktioner. Ved at give den enkelte forsker mulighed for at genotype tusindvis af udplantningsplanter i en kort periode, har Ice-Cap-metoden potentiale til at lette en række genetiske eksperimenter, som ellers ikke ville være praktisk at udføre. Flere eksempler er angivet nedenfor.

1. Genetic Mapping. Fine-skala genetisk kortlægning, kan fremskyndes, hvis forskeren er i stand til at identificere rekombination begivenheder inden for et bestemt interval langs kromosom ^3. Hvis dette interval medfører en meget kort genetiske afstand, så rekombination begivenheder vil være relativt sjældne i adskillelsen kortlægning befolkning. Af denne grund, kan det være nødvendigt at screene tusindvis af forskellige planter til at finde den ønskede recombinant individer. Denne proces kan i høj grad fremskyndes gennem brug af Ice-Cap. Selv i en tid med genom-dækkende re-sekventering, er det stadig nødvendigt at direkte påvise, at en given mutation er direkte ansvarlig for en fænotype af interesse. I disse tilfælde vil det være nødvendigt at adskille mutation af interesse fra andre nært forbundne mutationer for at bevise en kandidat mutation er faktisk sygdomsfremkaldende. I disse situationer vil Ice-Cap giver en effektiv metode til at bryde koblingen mellem et par af tæt forbundne mutationer.
2. Multi-mutanter. Det er blevet almindeligt, at forskere studerer Arabidopsis at kombinere mutant alleler fra flere forskellige loci til en enkelt person med henblik på at overvinde funktionelle redundans ^4-6. Som et eksempel overveje en sag, hvor man ønsker at kombinere mutant alleler fra fire forskellige loci i en enkelt plante gennem genetiske overfarten. Til dette projekt, vil det være nødvendigt at generere enn individ, der er heterozygot på disse fire loci som en del af passage ordningen. Når denne firedobbelt-heterozygot sætter frø, er det firedobbelt homozygote forventes at være til stede ved en hastighed på én ud af 256 i den resulterende population af afkom. Screening for denne sjældne enkelte af de traditionelle metoder ville være ganske arbejdskrævende. Til sammenligning ville bruge Ice-Cap til dette projekt giver videnskabsmand med en effektiv strategi til at identificere de sjældne firedoble homozygote i en enkelt generation.
3. iTILLING. Vores laboratorium for nylig beskrev en ny tilgang til screening for tilstedeværelsen af inducerede mutationer i gener af interesse i Arabidopsis ^7. Denne metode er en variation på en etableret teknik kaldet Tilling, der bruges til at finde mutationer i beordrede populationer af individer behandlet med et kemisk mutagen ^8-10. Vi har kaldt vores metode iTILLING fordi det er en individualiseret version af Tilling, der giver en INDividual videnskabsmand for at udrette noget, der traditionelt har krævet et stort forskerteam at fuldføre. Ice-Cap er en integrerende del af iTILLING metode ^7, som beskrevet nedenfor.

Ideen bag iTILLING er at producere en flygtig mutant befolkning, hvilket står i kontrast til de holdbare mutant populationer skabt til traditionelle tilling projekter. For iTILLING, er frø fra en bulked M2 befolkning indsyet i 50 til 100 Ice Cap blokke, og DNA er ekstraheret ved hjælp af Ice-Cap-metoden. Arabidopsis kimplanter placeres derefter ved 4 ° C, mens mutation screening udføres ved hjælp af Ice-Cap DNA Preps. Tomat planter opbevares ved 12 ° C.. Når frøplanter transporterer ønskede mutationer er blevet identificeret, er de inddrives fra Ice-Cap plader og overføres til jord. iTILLING er ikke beregnet til at give en langvarig mutant befolkningen for en hel forskning samfund til skærmen. I stedet iTILLING giver en strategi, deren forsker kan screene en brugerdefineret mutant befolkningen for mutationer i en håndfuld gener hurtigt, effektivt og på en relativt lav pris.

Vi har fundet Ice-Cap at være en effektiv metode til dyrkning og genotypebestemmelse Arabidopsis, tomat og ris. Vi forventer, at andre arter af planter også bør gøres til genstand for Ice-Cap. En begrænsning på de mange forskellige arter, der kan tilgodeses ved Ice-Cap er størrelsen af ​​frøene. Kun planter med frø lille nok til at passe ind i brønde på en 96-brønds plade vil være kompatibel med Ice-Cap i dens nuværende konfiguration.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
GenoGrinder	Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ	2000 Geno/Grinder	Machine for shaking Root Plates for DNA extraction
ABgene Thermo-Sealer	ABgene USA	AB-0384	Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers	Beckman Coulter	Allegra 25R	Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable
MicroFill Microplate Dispenser	BioTek www.biotek.com	AF1000A	Automated liquid dispenser for filling microplates
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet	Target Department Store	www.bialetti.com	This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap
Custom Made Metal Rack	Hardware Store		See text for full description
33 Liter plastic storage box	Target Department Store	Sterilite Brand	For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet
30 gallon per hour Fountain Pump	Sunterra	104506	Small submersible fountain pump available at garden supply stores
Hose for fountain pump	Any lab supply company		Hose compatible with fountain pump
Plastic Clamp	Hardware Store		Clamp to hold hose to cookie sheet
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates	BD Falcon www.bdbiosciences.com	351172	Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
3/32-inch diameter stainless steel balls	Hartford Technologies, Rocky Hill, CT	034-006-1K	Used to disrupt root tissue after harvest
3 inch Elastic hair bands	Local grocery store		Used to secure Root Plate to Seedling Plate
4 mm diameter wooden skewers	Local grocery store		These skewers are typically used to prepare kabobs
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit	Fisher Scientific	278012	96-well Seedling Plates with holes in bottom.
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate	Fisher Scientific	14-230-242	96-well Root Plates
Agar – cell culture tested	Sigma-Aldrich	A1296
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M2933
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Sigma-Aldrich	M-5524
Easy Peel heat sealing foil	ABgene USA	AB-0745	Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd	OfficeMax www.officemax.com	Item no. 21242139	Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage
Sealing Roller	Bio-Rad	MSR-0001	Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates
96-well metal thermal block	Cole-Parmer	36400-66	Used to freeze the Root Plates for tissue harvest
Whatman Filter paper	Whatman International	1002 090	Used for surface sterilizing seeds
Disposable Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm)	Target Department Store		Used to construct a dry ice/ethanol bath.