T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Summary

Este artigo apresenta o protocolo de T-maze testes utilizando um aparelho modificado automatizado para avaliar as funções de aprendizagem e memória em camundongos.

Abstract

Alternância forçado e tarefas esquerda-direita discriminação através do labirinto em T têm sido amplamente utilizados para avaliar trabalho e da memória de referência, respectivamente, em roedores. No nosso laboratório, foram avaliados os dois tipos de memória em mais de 30 estirpes de ratos geneticamente modificados utilizando a versão automática deste aparelho. Aqui, apresentamos o modificado aparelho T-maze operado por um computador com um sistema de vídeo monitoramento e nossos protocolos em um formato de filme. O aparelho de labirinto em T consiste de pistas, separada por portas de correr que pode abrir automaticamente para baixo, cada uma com uma caixa de início, uma pista de em forma de T, duas caixas com distribuidores automáticos da pelota em um lado da caixa, e dois em forma de L becos . Cada pista em forma de L está ligado à caixa de início de modo que os ratos pode retornar para a caixa de início, que exclui os efeitos da manipulação experimentador sobre o comportamento do rato. Este aparelho também tem uma vantagem que microdiálise in vivo, in vivo electrostáticos, techn optogeneticsiques pode ser realizada durante labirinto em T-desempenho, pois as portas são projetados para ir para o chão. Neste artigo filme, descrevemos labirinto em T tarefas usando o aparelho automático eo desempenho labirinto em T de + / α-CaMKII - ratos, que são relatados para mostrar a trabalhar défices de memória na tarefa do labirinto de oito braço radial. Nossos dados indicam que a α-CaMKII + / - ratos mostraram um déficit de memória de trabalho, mas sem comprometimento da memória de referência, e são consistentes com os achados anteriores usando a oito braço tarefa do labirinto radial, que apoia a validade do nosso protocolo. Além disso, os nossos dados indicam que os mutantes tendem a ter défices de reversão de aprendizagem, o que sugere que α-CaMKII deficiência provoca reduzida flexibilidade comportamental. Assim, o teste de labirinto em T usando o aparelho modificado automático é útil para a avaliação de trabalho e de referência de memória e flexibilidade comportamental em ratinhos.

Protocol

1. Configuração de aparelho

1. O aparelho automático modificado labirinto em T-(O'HARA e Co., Tóquio, Japão) é construído de brancos pistas de plástico com 25 cm de paredes elevadas ^1. O labirinto é dissociado em 6 áreas (A1, A2, S1, S2, P1, P2) por portas de correr (S1, S2, S3, a1, a2, P1, P2) (Figura 1) que podem ser automaticamente abertos para baixo. A haste do T é composto de área S2 (13 x 24 cm) e os braços do T compreendem áreas A1 e A2 (11,5 x 20,5 cm). Áreas P1 e P2 compreendem as passagens de ligação a partir do braço (área A1 ou A2) para o compartimento de início (S1 da área).
2. A extremidade de cada braço está equipado com um dispensador de sedimento que proporciona automaticamente um pelete de sacarose (20 mg, Fórmula 5 TUT, TestDiet, Richmond, IN, EUA) como uma recompensa. A ingestão de sedimento pelo rato é detectado pelo sensor de infravermelhos e é registada automaticamente por um computador.
3. A carga Coupled Device (CCD) da câmera é montada acima do aparelho para monitorar o mouse & #x2019; comportamento s, e as imagens do aparelho e do rato são capturados pelo computador.
4. Coloque o aparelho de labirinto em T numa sala insonorizada (170 x 210 x 200 cm, O'HARA e Co., Tóquio, Japão) quanto possível. O aparelho é iluminado por luzes fluorescentes a 100 lux no nosso laboratório. A intensidade da luz pode ser mais fraco do que este nível de lux, mas deve ser mantido a um nível constante durante todos os experimentos.

2. Preparação animal

1. Casa cerca de duas a quatro ratinhos por gaiola numa sala com temperatura controlada (23 ± 2 ° C) com um 12-h ciclo de luz / escuro (luzes acesas às 7:00 AM), de acordo com a orientação e protocolos estabelecidos pelo Animal Care locais Use e Comitê.
2. Transferir todas as gaiolas contendo ratinhos para a sala insonorizada a partir da sala de habitação, pelo menos, 30 min antes do primeiro ensaio começa.
3. Todos os experimentos devem ser realizados sempre durante o mesmo período de tempo (por exemplo, 9:00 PM às 6:00 PM). Durante o teste de PENo mesmo período, os indivíduos de cada genótipo ou condição experimental deve ser testado, a fim contrabalançadas, uma vez que pode haver um potencial efeito do tempo em um dia sobre o desempenho da tarefa.

3. A restrição alimentar

1. Até que o início da experiência, dá acesso livre a norma pelete Chow e água a ratinhos.
2. A partir de 1 semana antes das sessões de treino de pré-, pesar ratinhos diariamente e alimentá-los com a norma pelete Chow para manter 80% a 85% do seu peso corporal de alimentação livre ao longo da experiência.
3. Fornecer, diariamente, com oito pastilhas de sacarose por rato, além de padrão pelota de ração em sua gaiola casa para habituar as pelotas de sacarose até o início das sessões de pré-treinamento.

4. Habituação do aparelho e pré-treino

1. S Placepeletes de sacarose IX por rato para o centro de cada uma das seis compartimentos do aparelho, e um depósito de pelotas em cada bandeja dos dispensadores de alimentos.
2. Colocar todos os ratinhos numa gaiola para dentro do dispositivo e permitir-lhes explorar livremente o aparelho com todas as portas abertas durante 30 min.
3. A partir de 1 dia após a habituação, os ratos são diariamente submetida a um pré-formação. Com todas as portas fechadas eo sedimento depositado na bandeja de alimentos, em lugar do rato área A1. Se o rato consome a decorrer min pellet ou 5, transferir o mouse para A2 área e começar a pré-treinamento novamente. Tal formação é repetido cinco vezes por dia, e continuou até que os ratinhos consomem mais de 80% dos peletes.
4. Após as sessões de treinamento pré-são completa, os ratos são submetidos a um trabalho forçado ou uma alternância direita-esquerda tarefa de discriminação.

5. Tarefa de alternação forçado

1. Na tarefa de alternância forçada, cada ensaio consiste em uma fol escolha forçada de execuçãoseguido por uma corrida de livre escolha.
2. Execute o programa de aplicação (Imagem TM) para o início da tarefa, e coloque o mouse na caixa de início (S1 área).
3. Clique no botão Iniciar, e uma corrida da escolha forçada começa. Nesta execução, as portas da caixa de início (porta s2) e de qualquer área A1 (porta a1) ou A2 área (a2 porta) são abertas, e um sacarose pellet é automaticamente entregue na bandeja de alimentação da área com a porta aberta . O mouse é permitido entrar na área e consumir o sedimento. Quando o rato comeu o sedimento, a porta perto da bandeja de comida do braço que o mouse atualmente permanece (ou p1 porta ou p2) é aberta. Em seguida, o rato se aproxima da porta (quer S1 ou S3) vizinha da caixa de início, e quer P1 ou P2 a porta é fechada e as s1 porta (ou S3) é aberto de modo que o rato pode retornar à caixa de início. Se o mouse não consegue comer a pelota dentro de 30 segundos, a resposta é registrado como um "erro de omissão". Em seguida, o sedimento é removido automaticamente a partir da bandeja de alimentos e tele porta do braço que os ratinhos ficaram (quer P1 ou P2) é aberta, e, em seguida, o rato pode retornar à caixa de início.
4. Após a corrida da escolha forçada, a corrida livre escolha começa automaticamente. A porta S2 e ambas as portas A1 e A2 são abertas. O mouse é permitido escolher entre os dois braços. Se o mouse entra o braço oposto ao que foi forçado a escolher a longo da escolha forçada, sua resposta é considerada "correta" e do rato recebe um pellet de sacarose. Se o rato não comer o sedimento dentro de 30 segundos, a resposta é registada como um "erro de omissão", eo sedimento é removido automaticamente a partir da bandeja de alimentos. Se o mouse vai para o mesmo braço como que visitou na tarefa da escolha forçada, o mouse está confinado dentro da área por 10 segundos como uma pena ("Erro" de resposta). Em seguida, as portas de P1 (ou S1) e P2 (ou S3) são abertos, eo rato pode retornar à caixa de início.
5. Um rato é submetido a 10 ensaios consecutivos em uma sessão pordia (tempo de corte, 50 min). Os ratinhos de controlo são formados por dia para chegar a uma média de grupo de 80% de resposta correcta de uma sessão. A média do grupo de resposta correcta é calculado pela média das respostas correctas% de cada rato em uma sessão em cada grupo.
6. Depois de ratos controle e / ou experimentais são treinados para o critério, você pode ainda testar os ratos na tarefa de alternação tardia através da inserção de 3 -, 10 -, 30 - ou 60-S atrasos entre a escolha forçada e da livre escolha é executado.
7. Após cada sessão, retornar os ratos para a sua gaiola e limpe o aparelho com água hipocloroso super (pH 6-7) para evitar um viés baseado em pistas olfactivas.

6. Esquerda-direita tarefa de discriminação

1. Na tarefa de discriminação esquerda-direita, cada rato é dada uma corrida livre escolha de 10 ou 20 tentativas. Um sacarose pelete é sempre entregue para a bandeja de alimentos de um dos braços, a saber, o braço de meta. Os ratos têm de aprender a entrar no braço meta. A localização do metabraço é invariável entre os ensaios e as sessões, e é contrabalançado em ratos controle e experimentais.
2. Execute o programa de aplicação (Imagem TM) para o início da tarefa, e colocar um rato dentro da caixa de início (S1 área).
3. Clique no botão Iniciar e, em uma corrida livre escolha começa. Nesta execução, a porta S2 e ambas as portas A1 e A2 são abertos, e um distribuidor de pellet automaticamente proporciona um pelete para a bandeja de alimentos do braço meta. O mouse está autorizado a escolher livremente entre os braços direito e esquerdo. Quando o mouse entra o braço meta, ela é considerada uma resposta correta. Se o rato come o sedimento ou 30 seg decorrer, p1 porta (ou p2) é aberta. Quando o rato se aproxima da caixa de início, passando através do P1 área (ou P2), s1 porta (ou S3) é aberto de modo que o rato pode retornar à caixa de início.

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Discussion

Forçadas tarefas alternância e esquerda-direita discriminação utilizando o labirinto em T são usados ​​extensivamente para avaliar trabalho e da memória de referência, respectivamente, em roedores ^4,5. No labirinto em T-tarefas, sabe-se que os roedores podem usar diferentes estratégias para realizar as tarefas, com base em pistas espaciais e não espaciais, tais como labirinto extra-pistas, a configuração das pistas quarto, orientação do labirinto, e assim por diante ^6,7,8. Orientação do labirinto em uma sala e sua estabilidade, presença ou ausência de sinais de polarização na sala, e capacidade de roedores para ver sinais na sala pode afetar estratégias. Assim, os pesquisadores precisam considerar configuração e orientação do aparelho e sugestões em uma sala na realização de um experimento e uma interpretação de dados comportamentais. Em nosso laboratório, nós colocamos dois aparelhos em frente na mesma direção em direção a uma parede em uma sala à prova de som e objetos de conjunto, como uma porta da sala, lâmpadas fluorescentes no teto, paredes da sala, câmeras CCD deos aparelhos e suportes para acomodar gaiolas de rato, que podem servir como labirinto extra-pistas espaciais para ratos (ver Figura 1C).

Em muitos casos, os ensaios labirinto em T foram manualmente conduzida por um experimentador humano como se segue: Em cada ensaio, o experimentador coloca um pelete de sacarose na bandeja de alimentos, e abre as portas de guilhotina do aparelho para iniciar o ensaio. Então, quando um rato entra um dos braços, o experimentador fecha as portas, registra o comportamento do mouse, e transfere o mouse do braço para a caixa de início com a mão. As possíveis variáveis ​​de confusão de lidar com a interação com o genótipo do rato ou condição experimental pode afetar T-maze desempenho. Durante a última década, o teste modificado labirinto em T para uma tarefa de alternância contínua que não envolve a transferência manual do sujeito a partir do braço meta para trás para a caixa de início foi usado. ^9-11 Mesmo quando o aparelho, os protocolos de teste, e muitas variáveis ​​ambientais são vigorosamente equacionada, standardized testes comportamentais nem sempre produzem resultados semelhantes em diferentes laboratórios ^12,13. Experimentadores específicos realizando o teste pode ser única para cada laboratório e também pode influenciar o comportamento dos camundongos. Além disso, um experimentador humano é geralmente apto a fazer erros, como misplacing um pelete de sacarose, abrindo ou fechando as outras portas, bem como erros na localização do número de tentativa e cronometragem. Para reduzir a influência de variáveis ​​de confusão ea ocorrência de erros humanos, temos desenvolvido e usado o aparelho de labirinto em T automatizado, controlado por um sistema de vídeo-tracking com o programa de imagem TM. O aparelho T-maze melhor também tem vantagens que nos permitem usar microdiálise, eletrofisiologia, e técnicas optogenetics durante labirinto em T-desempenho, pois as portas são projetados para ir para o chão. Assim, o aparelho automatizado é uma ferramenta útil para facilitar os estudos sobre a neurobiologia da memória de trabalho e de referência em roedores.

Para permitir a execução automática e sucessiva de uma série de ensaios em uma sessão, os nossos protocolos têm algumas desvantagens potenciais. Por exemplo, na tarefa de alternância forçada, o tempo para os ratos para voltar ao S1 de A1 ou A2 poderia afetar seu desempenho. Pode não ser um problema sério, porém, desde P1 ficar ou área P2 em si pode ser um sinal espacial e uma estadia longa ou curta em qualquer área em uma corrida da escolha forçada pode não alterar uma carga de memória. Outro problema potencial é que trilha odor feita pelos ratinhos, em vez de memória de trabalho espacial, poderia ser usado. No entanto, depois de alguns testes, os odores podem ser sobrescritos várias vezes e se tornaria difícil de ser utilizada como estímulos. Além disso, na esquerda, luz tarefa de discriminação, os odores podem servir como pistas olfativas para os ratos para encontrar a localização de uma recompensa em ensaios sucessivos. As sugestões podem influenciar processo de aprendizagem e memória através de ensaios em uma sessão, que pode potencialmente ser um problema. No entanto,os ratos não podem usar a estratégia rastro de odor na primeira tentativa em uma sessão e assim os desempenhos dos primeiros testes serviria como um índice que é desprovido de um uso potencial da estratégia rastro de odor.

Como mostrado nos resultados representativos, as respostas correctas por cento dos ratinhos de controlo C57BL/6J gradualmente aumentada através das sessões em ambas as tarefas. Os resultados confirmam que camundongos C57BL/6J pode aprender a fazer escolhas corretas no automático modificada T-maze. Neste estudo, os ratos ficaram em cerca de 80% escolhas corretas e não mais, mesmo após o treinamento extensivo (ver Figura 2A). Considerando que eles continuam aparecendo alguns erros de omissão ao longo dos treinamentos, a sua motivação pode não ser tão alto para os ratos a atingir nível mais alto de desempenho. Na tarefa de alternância forçada, α-CaMKII + / - ratos mostraram um menor percentual de respostas corretas do que os ratos controle. Assim, os ratos mutantes exibida desempenho prejudicado comparado com os ratinhos de controlo nesta task. Este resultado é consistente com os resultados anteriores obtidos no teste de labirinto radial de oito braços ^2,14, fornecendo mais evidências de que α-CaMKII deficiência induz os déficits de memória de trabalho e que a tarefa de alternação forçado no aparelho T-maze automatizado detecta com precisão trabalhando déficits de memória dos ratos mutantes. Na tarefa de discriminação esquerda-direita, os resultados indicam que não α-CaMKII dose de deficiência de afetar a memória de referência. Como mostrado nos resultados das sessões de aprendizagem inversão, no entanto, α-CaMKII deficiência pode reduzir a flexibilidade comportamental. Os ratos mutantes também apresentado mais erros por omissão do que os camundongos de controle durante as sessões de aprendizagem reversa. O aumento do número de erros de omissão poderia reduzir a oportunidade de saber qual o braço está associada com a recompensa. Portanto, a aquisição de aprendizagem retardada pode ser devido ao aumento do número de erros de omissão durante as sessões iniciais, mas não para l inversão prejudicadaganhar. Outra possibilidade é que os mutantes podem ser confundidos com a mudança nas regras, o que pode induzir a erros de omissão e interferir com a função executiva. Assim, para tirar uma conclusão razoável, erros de omissão deve ser analisado, bem como percentual escolha correta.

A imagem do programa TM gera os resultados adicionais para a latência ea distância percorrida para completar a sessão, bem como a percentagem de resposta correcta e do número de erro de omissão. As diferenças na latência e distância percorrida para completar uma sessão pode ser interpretada como uma diferença no nível de atividade locomotora, tendência impulsiva para a escolha das armas, a motivação para realizar a tarefa, o nível de habituação à tarefa estratégia de aprendizagem, diferente e etc Quanto ao resultados representativos, α-CaMKII + / - ratinhos mostrou um menor latência e mais curta distância percorrida do que os dos controlos. Na verdade, α CaMKII + / - ratos mostraram uma actividade hyperlocomotor em comparação com tele controlar ratinhos ³ e este fenótipo poderia estão na base das diferenças nos índices.

No nosso laboratório, temos avaliado mais de 36 estirpes de ratos geneticamente modificados e ratinhos de tipo selvagem de controlo para um teste de labirinto em T, utilizando o aparelho automatizado para elucidar a relação entre os genes, cérebro, e comportamento ^15,16. Nós obtivemos um grande conjunto de dados brutos de mais de 1.200 camundongos e relataram os dados para o desempenho de T-maze em várias linhagens de camundongos mutantes ^3,16-22. Os dados de cepas já publicados em artigo de pesquisa estão incluídos no "Banco de Dados Fenótipo comportamental do rato", como um banco de dados público (URL: http://www.mouse-phenotype.org/~~V ). Alguns dos estudos demonstraram que camundongos com mutante Dtnbp1 ^1, Nrd1 ^20, ou PLP1 ²¹ genes apresentam déficits de memória de trabalho. Assim, o nosso protocolo padronizado para as tarefas labirinto em T com o automatizadoaparelho é adequado para detectar efeitos genéticos sobre a função de memória entre ratinhos de controlo mutantes e de tipo selvagem. Os protocolos de testes comportamentais precisam ser padronizados, replicado, e os resultados comparados entre laboratórios. O aparelho de labirinto em T melhorada leva à automatização dos procedimentos de ensaio, que pode contribuir para a padronização dos protocolos usados ​​em laboratórios.

Como mostrado no artigo de vídeo, a versão atual do aparelho e programa pode permitir-nos testar preto ou camundongos agouti, mas ratos não albinos. Agora, estamos a produzir uma versão modificada do sistema para permitir ratinhos albinos a ser testado. O sistema tem uma vantagem que microdiálise in vivo, in vivo electrofisiologia, e as experiências optogenetics pode ser realizada durante labirinto em T de teste, uma vez que as portas estão concebidos para ir para baixo sob o chão. Por exemplo, alguns pesquisadores podem tentar investigar as propriedades eletrofisiológicas de neurônios no hipocampo durante a escolha de armasapesar de algumas melhorias do aparelho podem ser necessárias para minimizar o ruído elétrico das portas e atuadores mecanismo de pelotas de remoção.

Tomados em conjunto, labirinto em T forçado tarefas alternância e esquerda-direita discriminação usando o aparelho modificado automática são úteis para a avaliação de trabalho e de referência de memória e flexibilidade comportamental em ratinhos.