De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.
De Target ID bibliotheek is ontworpen om te helpen bij ontdekking en identificatie van microRNA (miRNA) doelstellingen. De Target ID Library is een plasmide-gebaseerde, genoom-brede cDNA-bibliotheek gekloneerd in de 3'UTR stroomafwaarts van de dual-selectie fusie-eiwit, thymidinekinase-zeocine (TKzeo). De eerste ronde van selectie is voor een stabiele transformanten, gevolgd met de introductie van een miRNA van belang, en ten slotte, het selecteren van cDNA's met de miRNA's doel. Geselecteerde cDNA's worden geïdentificeerd door sequencing (zie Figuur 1-3 voor Target ID Bibliotheek Workflow en details).
Om brede dekking van het menselijk transcriptoom te garanderen, werden Target ID Bibliotheek cDNA's gegenereerd via oligo-dT priming het gebruik van een pool van totaal RNA bereid uit meerdere menselijke weefsels en cellijnen. Resulterende cDNA van 0,5 tot 4 kb, met een gemiddelde grootte van 1,2 kb en werden gekloneerd in de p3TKzeo dubbele selectie plasmide (zie figuur 4 voor plasmide kaart). Het gen doelen weergegeven in de litheek is te vinden op de Sigma-Aldrich webpagina. Resultaten van Illumina sequentie (tabel 3) blijkt dat de bibliotheek 16922 van 21.518 unieke genen in UCSC RefGene (79%) of 14.000 genen met 10 of meer staat (66%) omvat.
microRNA's zijn 20-24 nucleotide RNA's die de genexpressie reguleren post-transcriptie door remming van mRNA vertaling, en vaak, destabilisatie van de beoogde mRNA (besproken in [6]). Een enkele miRNA kunnen zelf een paar honderd mRNA naar een cel reageert op ontwikkelings-en signalen uit de omgeving te controleren. Het identificeren en valideren van doelwit mRNA's is essentieel in het bepalen van een miRNA de rol en functie in deze routes. Echter, target identificatie is niet eenvoudig, omdat, in dieren, miRNAs en hun doel sites zijn niet volledig complementair. De "zaad" gebied, gebaseerd 2 tot 7 van het 5'-uiteinde van de miRNA, meestal complementair aan de doelstellingen. Er zijn echter vele uitzonderingen op het zaad regel-en downstream-base-paring kan compenseren voor een onvolmaakte zaad wedstrijd. Een aantal van de computer algoritmes zijn ontwikkeld om miRNA doelen op basis van zaad matching-en downstream-compensatie, doelstructuur voorspellen eend positie, volgorde behoud, en verschillende andere parameters die zijn waargenomen voor experimenteel gevalideerde targets (besproken in [7]). Terwijl in silico voorspellingen zijn handig en doen identificeren aan geldige miRNA doelen, de meeste voorspelde genen niet experimentele validatie testen, en veel feitelijke prestatiedoelstellingen worden niet voorspeld. Aangezien computeralgoritmen gebaseerd op vooraf bepaalde doel functies ze niet toe ontdekking targets die afwijken van hetgeen reeds bekend.
Een aantal experimentele systemen zijn met succes gebruikt om te identificeren of te ontdekken functionele miRNA doelen in levende cellen. Deze globale screening methoden omvatten microarrays en RNA-sequencing, RNA co-immunoprecipitatie (RIP), en stabiele isotopen Labeling met aminozuren in Cell cultuur (SILAC), een proteomics methode (beoordeeld in [7]). Elke methode heeft voor-en nadelen. Aangezien miRNA gericht destabiliseert vaak een mRNA en leidt tot de afbraak, verlies or winst in mRNA niveau na de invoering van een miRNA na te bootsen of remmer respectievelijk, kan identificeren miRNA doelen. Dit verlies of winst van mRNA wordt gemakkelijk gedetecteerd door middel van microarray of diep-sequencing. Terwijl mRNA detectiemethoden zijn eenvoudiger en gevoeliger dan eiwitten detectiemethoden, zal mRNA detectie missen elke miRNA targets die niet worden afgebroken. Recente rapporten van de Bartell lab vergelijken van miRNA doel de resultaten van RNA-detectie met die van SILAC [8] of ribosoom profilering [9] blijkt dat zoogdieren miRNAs voornamelijk te handelen door het verminderen van doel-mRNA niveaus. Maar veel andere laboratoria werken met individuele miRNA waargenomen doelen verandering in de eiwitten, maar geen verandering in mRNA niveau. Verslagen van wat lijken te translationeel regelgeving zonder waarneembare mRNA verlies zijn onder andere: miR-10b op HOXD10 [10], miR221/222 op p27kip1 [11], miR-21 op Pdcd4 [12], miR-126 op p85β [13] , miR-34 op SIRT1 [14], miR-21 op PTEN [15], miR-302d op Arid4b [16], miR-200C op JAG1 [17], en miR-299, 297, 567, eene 609 voor VEGFA [18]. Bovendien Clancy et al. [19] onlangs gemeld dat translationele regulatie door laten we-7 werd pas ontdekt wanneer individuele mRNA isovormen dat het laat-7 doelplaats bevatten werden selectief gedetecteerd. Dit laatste blijkt dat, tenminste in sommige gevallen translationele regeling kan worden vergeten een samengesteld profiel – dat, wanneer alle mRNA isovormen gedetecteerd als een mRNA – zoals verkregen met vele microarray en sequentie-analyses. Co-immunoprecipitatie van miRNA-mRNA-complexen via Argonaute (meestal ago2) of een andere geassocieerd eiwit (RNA immunoprecipitatie, of RIP) zal isoleren miRNA doelen los van Verordening mechanisme. Daarnaast, RIP detecteert endogene, en vermoedelijk biologisch relevante, interacties. Het is echter niet bekend of alle miRNA-mRNA interacties functioneel zijn, en RIP zou missen mRNA doelen die associëren slechts tijdelijk of snel afgebroken. Bovendien moeten bepaalde miRNA-mRNA partners worden afgeleid bioinformatitisch omdat alle miRNA-mRNA paar co-neergeslagen bij elkaar. Tot slot, SILAC identificeert direct het eindproduct van miRNA regelgeving, het eiwit zelf, maar is ongevoelig en daardoor mist zeldzame eiwitten en kleine vouw veranderingen in eiwit niveaus.
In het licht van de beperkingen met de huidige miRNA target identificatie methoden, voelden we ons een extra wereldwijde test om functionele miRNA targets te identificeren door een alternatief mechanisme nodig was. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een vergunning een technologie uitgevonden door Joop Gaken en Azim Mohamedali van King's College in Londen. Hun uitvinding is een dubbele selectie fusie-eiwit, in het bijzonder, een thymidine kinase-zeocine fusie, gereguleerd door een cDNA-bibliotheek van de potentiële miRNA doelsequenties in zijn 3'UTR. Stabiel getransfecteerde cellen met expressie en TKzeo-cDNA constructen kunnen worden geselecteerd zeocine, zoals in figuur 2. Na het uiten van een miRNA van belang, kan dat miRNA's doelstellingen worden gekozen with ganciclovir, zoals in figuur 3. Ganciclovir doodt cellen die thymidine kinase, dat wil zeggen, alle cellen die TKzeo-cDNA ontbreekt een streefcijfer voor de miRNA van belang. Gerichte cDNA kan worden geïsoleerd door PCR amplificatie van DNA uit cellen die ganciclovir behulp van primers die de flank cDNA en PCR-producten kunnen worden gesequenced om targets te identificeren overleven.
Wij hebben de King's College in technologie in een nieuwe tool voor wereldwijde identificatie en de ontdekking van functionele menselijke miRNA doelen – De opdracht Target ID Library. Met de Target ID Bibliotheek, kunnen gebruikers isoleren miRNA doelstellingen door een reeks van zoogdiercelculturen transfectie en drugs selectie stappen. De bibliotheek is zeer uitgebreid, en bevat 66-79% van de menselijke genen. De eerste resultaten geven aan dat beide eerder ontdekt en nieuwe doelen kunnen worden geïsoleerd van de MISSION Target ID Library.
Hoewel het protocol van enige lengte,het gebruik van de Target ID bibliotheek moet een standaard moleculaire lab technieken – zoogdiercellen cultuur, transfectie, drugs-selectie, PCR en sequencing – en daarom moet goed van de mogelijkheden van de meeste biologen. Wij stellen voor dat voldoende aandacht wordt besteed aan een goede opzet van het experiment, het optimaliseren van kweekomstandigheden, en vooral, pre-testen van elk nieuw type cel optimaal geneesmiddel te bepalen voor de selectie stappen (kill-curves) naar succes met de Target ID Bibliotheek te garanderen.
Zoals bij alle miRNA target identificatie methoden, is het sterk aanbevolen om doelstellingen die zijn geformuleerd screening van de Target ID Library worden gevalideerd met een tweede methode, zoals microarray, qRT-PCR, reporter assay (dat wil zeggen, luciferase), of West-analyse.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken het hele Sigma Life Science Mission Target ID Bibliotheek development team, in het bijzonder Kevin Gutshall voor het vinden van de technologie en het onderhandelen over de licentievoorwaarden, en Heather Holemon voor haar steun en deelname aan het oplossen van problemen vruchtbare discussies. We danken ook dr. Joop Gäken van King's College in Londen voor het vrij delen van niet-gepubliceerde resultaten en suggesties, en Qazi Hamid van RxBiosciences voor het bereiden van een grote partij van cDNA en zijn persistentie in het krijgen van het gekloond. We willen Nan Lin en Scott Bahr erkennen van SAFC voor het uitvoeren van cDNA arrays en data-analyse.
Missie is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |