Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, genomet hela samling av klonat cDNA används för att identifiera miRNA mål. Här visar vi dess användning och tillämpning.
Target ID-bibliotek är utformad för att hjälpa till upptäckt och identifiering av mikro-RNA (miRNA) mål. Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, Genomvid cDNA-bibliotek klonat in i 3'UTR nedströms från dubbla valet fusionsprotein, tymidinkinas-Zeocin (TKzeo). Den första omgången av selektion är för stabila transformanter, följt av införande av en miRNA av intresse, och slutligen, selektering med avseende på cDNA-sekvenser innehållande miRNA mål. Valda cDNA identifieras genom sekvensering (se figur 1-3 för Target ID-bibliotek arbetsflöde och detaljer).
För att säkerställa en bred täckning av den mänskliga transkriptom var Target ID-bibliotek cDNA genereras via oligo-dT priming med en pool av totalt RNA framställt från flera mänskliga vävnader och cellinjer. Resulterande cDNA intervallet från 0,5 till 4 kb, med en genomsnittlig storlek av 1,2 kb, och klenades in i p3TKzeo dubbla selektion plasmiden (se figur 4 för plasmid karta). De genmål representerade i litek kan hittas på Sigma-Aldrich hemsida. Resultaten från Illumina sekvensering (tabell 3), visar att biblioteket innehåller 16.922 av de 21,518 unika gener i UCSC RefGene (79%), eller 14.000 gener med 10 eller flera läsningar (66%).
mikroRNA är 20-24 nukleotid RNA som reglerar genuttrycket efter transkriptionellt genom att hämma mRNA translation, och ofta, destabilisera de riktade mRNA (över [6]). En enda miRNA kan reglera flera hundra mRNA för att styra en cell svar på utvecklings-och miljö-signaler. Identifiering och validering mål mRNA är viktigt att bestämma ett miRNA roll och funktion i dessa vägar. Dock är målet identifiering inte okomplicerad eftersom det i djur, miRNA och deras platser mål inte är helt komplementära. "Fröet"-regionen, baserar 2 till 7 från 5'-änden av miRNA, är vanligen komplementär till sitt mål. Det finns dock många undantag från fröet regel och nedströms bas-parning kan kompensera för en bristfällig frö match. Ett antal algoritmer har utvecklats för att förutsäga miRNA mål som bygger på utsäde matchning och nedströms ersättning målstruktur end position, sekvenskonservering, och diverse andra parametrar som har undersökts för experimentellt validerade mål (över [7]). Även i silico förutsägelser är bekväma och gör identifiera många giltiga miRNA mål, förutspådde de flesta gener inte experimentella validering tester och många verkliga mål inte förutses. Eftersom algoritmer är baserade på tidigare fastställda mål funktioner, tillåter de inte upptäckten av mål som avviker från vad som redan känt.
Ett antal experimentella system har använts framgångsrikt för att identifiera eller upptäcka funktionella miRNA mål i levande celler. Dessa globala screeningsmetoder innefattar mikromatriser och RNA-sekvensering, RNA samimmunfällning (RIP), och stabil isotop märkning med Aminosyror i cellkultur (SILAC), en metod proteomik (översikt i [7]). Varje metod har sina fördelar och nackdelar. Eftersom miRNA inriktning destabiliserar ofta en mRNA och leder till dess nedbrytning, förlust or vinst i mRNA nivå efter att införa en miRNA efterlikna eller hämmare, respektive kan identifiera miRNA mål. Denna förlust eller vinst av mRNA lätt upptäcks av microarray eller djup sekvensering. Medan mRNA detekteringsmetoder är enklare och mer känsliga än metoder protein detektion kommer mRNA detektion missar några miRNA mål som inte bryts ned. Nya rapporter från Bartell labbet jämföra resultat miRNA målet från RNA-detektion med dem från SILAC [8] eller ribosomen profilering [9] visar att däggdjur miRNA huvudsakligen verkar genom att minska nivåerna mål-mRNA. Emellertid, har många andra laboratorier som arbetar med individuella miRNA mål detekterad förändring i proteinet men ingen förändring i mRNA-nivå. Rapporter om vad som verkar vara translationell reglering utan påvisbar mRNA förluster inkluderar: miR-10b den HOXD10 [10], miR221/222 den p27kip1 [11], miR-21 på Pdcd4 [12], miR-126 på p85β [13] , miR-34 den SIRT1 [14], miR-21 på PTEN [15], miR-302d den Arid4b [16], miR-200C på JAG1 [17] och miR-299, 297, 567, ennd 609 om VEGFA [18]. Dessutom Clancy et al [19] rapporterade nyligen att translationell reglering av låt-7 endast upptäcktes när enskilda mRNA-isoformer som innehåller LET-7 målområdet upptäcktes selektivt. Den senare tyder på att åtminstone i vissa fall kan translationell reglering förbises i en sammansatt profil – det vill säga när alla mRNA-isoformer upptäcks som en mRNA – som erhållits med många microarray och analyser sekvens. Co-immunoprecipitering av miRNA-mRNA-komplex via argonaute (vanligtvis ago2) eller någon annan tillhörande protein (RNA immunoprecipitation, eller RIP) kommer att isolera miRNA mål oberoende av reglering mekanism. Dessutom upptäcker RIP endogena, och förmodligen biologiskt relevanta interaktioner. Det är dock inte känt om alla miRNA-mRNA interaktioner är funktionella och RIP skulle missa några mRNA mål som associerar enbart övergående eller snabbt försämras. Dessutom måste särskilda miRNA-mRNA partner härledas bioinformatitiskt eftersom alla miRNA-mRNA paren samutfällas tillsammans. Slutligen identifierar SILAC direkt slutprodukten av miRNA reglering, proteinet i sig, utan är okänslig och därför missar sällsynta proteiner och små gånger förändringar i protein nivåer.
Mot bakgrund av de begränsningar som nuvarande identifiering miRNA mål metoder kände vi ytterligare ett globalt analys för att identifiera funktionella miRNA mål genom en alternativ mekanism behövdes. För att uppfylla detta behov licensierat vi en teknik som uppfanns av Joop Gaken och Azim Mohamedali av Kings College London. Deras uppfinning är en dubbel selektion fusionsprotein, specifikt en tymidinkinas-zeocin fusion regleras genom en cDNA-bibliotek av potentiella sekvenser miRNA mål på dess 3'UTR. Celler stabilt transfekterade med och uttryckande TKzeo-cDNA-konstruktioner kan väljas med zeocin, såsom illustreras i fig. 2. Efter att uttrycka en miRNA av intresse, som kan miRNA: s mål väljas wite ganciklovir, såsom visas i fig 3. Ganciklovir dödar celler som uttrycker tymidinkinas, det vill säga, vilka som helst celler som uttrycker TKzeo-cDNA saknar ett mål för miRNA av intresse. Riktad cDNA kan isoleras genom PCR-amplifiering av DNA från celler som överlever ganciklovir med primrar som flankerar cDNA och PCR-produkter kan sekvenseras för att identifiera mål.
Vi har utvecklat Kings College teknik i ett nytt verktyg för global identifikation och upptäckt av funktionella mänskliga miRNA mål – uppdraget Target ID-bibliotek. Med målet ID-bibliotek, kan användare isolera miRNA mål genom en serie av däggdjur cellodling transfektion och drog stegen urval. Biblioteket är omfattande och innehåller 66-79% av mänskliga gener. Initiala resultat indikerar att både tidigare upptäckt och nya mål kan isoleras från beskickningen Målidentiteten bibliotek.
Även om protokollet är av viss längd,användning av Target ID-bibliotek kräver vanliga molekylära lab tekniker – däggdjursceller kultur, transfektion, läkemedel urval, PCR och sekvensering – och därför bör vara väl inom de medel de flesta biologer. Vi föreslår att tillräcklig uppmärksamhet ägnas åt lämplig experimentell design, optimering odlingsbetingelser, och viktigast av allt, pre-test varje ny celltyp för att bestämma optimala läkemedelsnivåer vid urvalet stegen (kill-kurvor) för att säkerställa framgång med målet ID-bibliotek.
Som med alla miRNA mål identifieringsmetoder, är det starkt rekommenderat att målen identifierats genom screening biblioteket Target ID kan valideras med en andra metod, såsom microarray, QRT-PCR, reporter analys (dvs. luciferas) eller Western analys.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar hela Sigma Life Science Mission Target ID laget Bibliotek utveckling, särskilt Kevin Gutshall för att hitta den teknik och förhandla licensvillkoren och Heather Holemon för hennes stöd och deltagande i givande felsökning diskussioner. Vi tackar också Dr Joop Gäken av Kings College London för fritt dela opublicerade resultat och förslag och Qazi Hamid i RxBiosciences för att framställa en stor sats av cDNA och hans uthållighet att få det klonas. Vi vill tacka för Nan Lin och Scott Bahr från SAFC för att utföra cDNA arrayer och dataanalys.
Mission är ett registrerat varumärke för Sigma-Aldrich Biotechnology LP
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |