GENPLAT: une plate-forme automatisée pour Discovery enzymatique de la biomasse et l'optimisation Cocktail

Summary

GENPLAT (Plateforme Enzyme GLBRC) est une plate-forme automatisée pour la découverte et l'optimisation des cocktails d'enzymes de dégradation de la biomasse. Il peut être adapté à plusieurs matières premières et des mélanges d'enzymes contenant de multiples composants.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. La production d'enzymes Produire des protéines dans Pichia pastoris par clonage des gènes correspondants dans des vecteurs ou des pPICZ pPICZα et sa transformation en P. pastoris. Cultiver des cellules dans 300 ml de lots dérouté flacons de 500 ml de méthanol à l'induction de tous les h 24 (Banerjee et al., 2010a). Concentré et dessaler les filtrats de culture par filtration à flux tangentiel. Stocker les enzymes dans de petites aliquotes de 20% de glycérol à -80 ° C. La gamme de concentration est 1-10 mg / ml. 2. Conception de l'expérience Entrez le nombre d'enzymes pour être testés, leurs supérieurs et inférieurs des proportions (par exemple, une proportion plus faible de 5% pour les enzymes de base), et le type de conception expérimentale (par exemple, quadratique ou cubique) dans la conception-Expertsoftware. Calculez le montant en ug de chaque enzyme à ajouter pour faire un chargement total de 15 mg / g de glucane, puis calculer le montant de chaque enzyme en ul à ajouter àchaque réaction. Générer feuilles de calcul Excel en spécifiant matériel de laboratoire de source, puits de source, du matériel de laboratoire de destination, des puits de destination, et les volumes de transfert pour distribution d'eau et d'enzymes selon la conception expérimentale et l'importer dans le logiciel Biomek FXP utilisant la fonction de transfert-de-fichier. 3. L'hydrolyse enzymatique Suspendre la boue de la biomasse dans 50 mM citrate de sodium, pH 4,8, contenant 5 ug / ml de tetracycline et 5 ug / ml de cycloheximide, dans le réservoir à aubes. Robotisé de pipette 200 pl de la suspension dans chaque puits d'une plaque 96 puits de réaction en utilisant des puits profonds Span-8 embouts de pipettes 1000-ul avec la dernière 0.5 cm coupés. Mélangez le coulis une fois à 100 l / sec puis aspirer le même volume du réservoir de paddle et répartir dans les assiettes. Distribuer les enzymes dans la même assiette en utilisant le programme est entré dans le FX Beckman. Sceau des plaques avec capmats perçable. Inversez et frappezles plaques à plusieurs reprises pour surmonter la tension de surface. Placez les plaques à 50 ° C pendant 48 h dans l'hybridation incubateur tournant à 10 rpm. 4. Détermination de Glc et Xyl Centrifuger les plaques de réaction pendant 3 min à 1250 xg dans une centrifugeuse à godets oscillants. Transférer 100 ul du surnageant dans réguliers plaques à 96 puits en utilisant la gousse AP96 du FX Biomek. Incuber les plaques à 90-95 ° C pendant 10 min afin d'inactiver les enzymes, puis centrifuger à 1250 xg pendant 30 sec. Pour des mesures de Glc, transférer 12 ul des surnageants en emploi régulier plaques à 96 puits. Ajouter 192 ul de la glucose oxydase / peroxydase (goPod) réactif. Incuber les plaques à 50 ° C pendant 20 min et lire les absorbances à 510 nm dans un lecteur de microplaques. Blank est mélange réactionnel sans enzyme. Pour des mesures Xyl, transfert 4 pl dans 384 puits. Ajouter les réactifs de dosage et de lire les plaques à 340 nm. Viergeest le mélange réactionnel sans enzyme. 5. Analyse des données Convertir les valeurs d'absorbance à leur Glc% et des rendements sur la base des Xyl connue Glc et le contenu Xyl de la biomasse d'origine. Importer ces pourcentages que les réponses dans le logiciel Design-Expert. Vérifiez la paramenters statistiques pour être sûr que les critères d'un modèle robuste sont remplies. Confirmer la meilleure prédiction du modèle expérimental. 6. Les résultats représentatifs avec GENPLAT: (1) Création de mélanges optimisés des individuels protéines pures. Les résultats indiquent que les enzymes sont importants, et dans quelles proportions, et aussi quelles enzymes ne sont pas importants. Certaines protéines qui sont abondantes dans le T. reesei sécrétome (Nagendran et al., 2009), comme Cip1 et CIP2, semblent jouer aucun rôle dans la libération Glc à partir de maïs prétraités par l'expansion de fibres d'ammoniaque (AFEX) ou alcalines hyd Stover peroxyde d'Rogen (AHP) (Banerjee et al., 2010b). D'autre part, certaines protéines sont importantes inattendue. Par exemple, l'endo-xylanases de familles Hydrolase glycosyle 10 et 11 sont toutes deux importantes pour Glc libération; une xylanase peut pas se substituer à l'autre (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, une protéine mineure dans le T. reesei sécrétome, est très important pour Glc mais pas Xyl communiqué. Certaines enzymes sont importantes pour la libération des deux Glc et Xyl, alors que d'autres ne sont nécessaires que pour l'une ou l'autre (Banerjee et al., 2010c). Un mélange synthétique contenant 16 éléments, chacun à une concentration de 0,94 mg / ml (c'est à dire, un mélange non optimisé), a publié 38% de la disposition du Glc AFEX-prétraités DDG. Dans des conditions identiques hydrolyse, un mélange optimisé, dans laquelle les concentrations des 16 composantes variait de 0% à 32%, a publié 52% de la CGL (Fig. 2). Cette expérience illustre l'utilité de construire des mélanges définis. _content "> (2) Création de cocktails optimisé pour un prétraitement différent / combinaisons substrat. actuelle des préparations commerciales sont cellulase" one-size-fits-all ". En réalité, le meilleur cocktail dépend à la fois le substrat et le prétraitement. Un seul produit tels que Accellerase 1000 donne des rendements différents de différents substrats prétraités de la même manière, et à partir du même substrat exposée à différents prétraitements (Fig. 1). Nous avons utilisé pour optimiser les mélanges GENPLAT des enzymes pures de prétraitement des matières premières et de multiples mutiple (Banerjee et al., 2010c). figure 2 montre comment les proportions optimales d'enzymes de 16 enzymes pures diffère du maïs AFEX-prétraités canne, le maïs PLA-prétraités Stover et AFEX-prétraités DDG. Seulement 11 enzymes sont présentés dans la figure 2. optimale parce que la proportions des cinq autres (Cel61B, AbfB, Cip1, point d'appel 2, et Cel12A) ont été trouvés à 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) découverte de nouvelle enzyme </strong>. La construction de mélanges optimisés des protéines pures est un processus continu. Comme de nouvelles protéines sont disponibles sous forme pure (à partir de sources commerciales, par l'expression hétérologue, ou par purification), ils peuvent être testés systématiquement en les ajoutant à l'ensemble actuel optimisé. Les nouvelles protéines qui contribuent à Glc ou Xyl communiqué deviennent alors partie intégrante d'un nouveau jeu optimisé. De cette façon, GENPLAT devient une plate-forme pour l'identification de nouvelles enzymes pour la déconstruction de la biomasse. Nous avons fait des extraits de champignons autres que T. reesei et A. Niger cultivés sur différents substrats. Un extrait particulièrement stimulé le rendement Glc lorsqu'il est ajouté à notre noyau. La protéine responsable a été purifié et montré être un roman de glycosyl hydrolase pas présent dans toute préparation enzymatique commerciale (Banerjee et Walton, résultats non publiés). (4) Découverte de la meilleure des enzymes. Ayant montré avec GENPLAT laquelle les enzymes sont les plus importants de la dégradation d'unparticulier la biomasse, nous avons une meilleure compréhension de laquelle les enzymes devrait être le centre d'amélioration. Mieux exemples des enzymes essentielles pourraient être trouvés par la recherche dans la nature ou fabriqués par l'ingénierie des protéines. (Une enzyme pourrait être «mieux» que son homologue de T. reesei de plusieurs façons, selon la propriété désirée, par exemple, l'activité spécifique plus élevée, une plus grande synergie, une diminution de la sensibilité protéolytique, ou une meilleure stabilité thermique). GENPLAT fournit une plate-forme significative pour doser les enzymes potentiellement mieux, car il utilise un cocktail réaliste complexes (important car aucune enzyme biomasse fonctionne en vase clos) et un substrat réaliste (important car les résultats avec de la cellulose pure ou d'autres substrats artificiels peuvent ne pas être pertinents pour lignocellulosiques naturelles matériaux). (5) l'optimisation de l'enzyme de commerce. Quantité suffisamment importante d'enzymes pures n'existent pas encore dans le monde réel. Jusqu'à ce qu'ils font, l'éthanol Proproducteurs doivent compter sur des produits commerciaux tels que Accellerase 1000 et MultifectXylanase. Toutefois, les mélanges d'enzymes commerciaux fonctionnent généralement mieux que tout autre individu, et GENPLAT peut être utilisé pour la conception optimisée de multiples cocktails enzymes commerciales. La figure 3 montre l'utilisation de GENPLAT pour optimiser un mélange de quatre préparations enzymatiques commerciales. Les proportions optimales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG ont été trouvés à 47% Accellerase1000, 27% Multifect pectinase, 22% Novozyme 188, et 4% Multifect xylanase (Banerjee et al., 2010c). La figure 3B montre les différences dans le rendement du Glc AFEX-DDG avec quatre préparations enzymatiques; le mélange optimisé commerciale donne un rendement plus élevé que Glc Accellerase1000 seul, SpezymeCP seul, ou un mélange de 16 composants synthétiques. Cette expérience indique également que le mélange de 16 composant synthétique qui manque un ou plusieurs enzymes nécessaires à la libération optimale Glc, qui sont présents dans un ou plusieurs des enzymes commerciales. GENPLAT peut nous êtreED afin d'identifier de tels composants. Figure 1. Pas de préparation enzymatique commerciale unique est optimale pour tous les supports et tous les prétraitements. Cinq substrats et trois prétraitements ont été comparés dans des conditions similaires de broyage (0,5 mm la taille des particules), le chargement d'enzymes (15 mg / g de glucane), et les conditions de l'hydrolyse (48 h, 50 ° C). A. La digestion des différents substrats prétraités AFEX- avec Accellerase 1000. Digestion B. canne de maïs prétraités par trois méthodes différentes avec Accellerase 1000 (voir Banerjee et al., 2010c). Figure 2. Proportions optimales de 11 enzymes pour la libération de Glc d'AFEX-canne de maïs prétraités (AFEX-CS), alcalines d'hydrogène peroxyde de maïs prétraités Stover (PLA-CS), ou AFEX-prétraitées séchées distillentvailleurs céréales (AFEX-DDG). Les données proviennent de Banerjee et al. (2010c). Numéros en haut des barres sont les rendements Glc que un pour cent du total Glc dans l'échantillon de la biomasse. Figure 3. A. L'utilisation de GENPLAT pour produire un mélange optimisé de quatre préparations enzymatiques commerciales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG. Multifect xylanase fait la plus petite contribution (4%) et a donc été omis dans ce diagramme ternaire. B. rendements Glc d'AFEX-DDG avec des traitements enzymatiques différentes, dans des conditions identiques hydrolyse (15 enzymes glucane mg / g, 48 h, 50 ° C) . "Quatre-composante commerciale" a les proportions déterminées par l'expérience le montre la figure. 3A.

Discussion

Il est largement reconnu que la réduction du coût des enzymes est important pour le développement d'une industrie d'éthanol lignocellulosique économique. Actuellement disponibles cocktails enzymatiques commerciales sont des mélanges complexes et mal définies de nombreuses protéines (Nagendran et al., 2009), et ils sont adaptés pour une utilisation essentiellement sur l'acide prétraité les tiges de maïs. Afin d'accélérer le développement de cocktails enzymatiques mieux, plusieurs laboratoires ont développé des plates-formes à haut débit pour la découverte et la caractérisation d'enzymes. Les efforts dans ce domaine ont intégré un ou plusieurs des propriétés suivantes ont également trouvé dans GENPLAT: robotique de distribution d'enzymes et de boues de la biomasse, la conception statistique de l'expérience et / ou la détermination automatisée de Glc et Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et al. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT étend ces efforts antérieurs, la plupart de manière significative dans la complexité des mélanges d'enzymes qui peuvent être analysés à partir au plus 6 composantsles études antérieures à plus de 16 dans notre dernier travail (Banerjee et al., 2010c). D'autres caractéristiques clés de GENPLAT sont l'utilisation d'une chambre de mélange billes (réservoir aube) qui peuvent garder boues tiges suspendues pendant la distribution; mélange en douceur lors de la digestion d'ici la fin de plus en bout de rotation, et automatisé dosage colorimétrique du Glu et Xyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)