GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) ist eine automatisierte Plattform für die Entdeckung und Optimierung von Enzym-Cocktails für Biomasse Abbau. Es kann zu mehreren Rohstoffen und Mischungen von Enzymen, die mehrere Komponenten angepasst werden.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Enzymproduktion Produzieren Proteine ​​in Pichia pastoris durch Klonierung der entsprechenden Gene in Vektoren pPICZ oder pPICZα und die Umwandlung in P. pastoris. Wachsen Zellen in 300-ml Ansätzen in verblüffte 500-ml-Kolben mit Methanol Induktion alle 24 h (Banerjee et al., 2010a). Konzentrieren Sie sich und entsalzen die Kultur Filtrate durch Tangentialflussfiltration. Bewahren Sie die Enzyme in kleinen Portionen in 20% Glycerin bei -80 ° C. Der Konzentrationsbereich ist 1-10 mg / ml. 2. Design of Experiment Geben Sie die Anzahl der Enzyme getestet werden, deren obere und untere Proportionen (zB einen geringeren Anteil von 5% für Kern-Enzyme), und die Art des experimentellen Designs (zB quadratisch oder kubisch) in die Design-Expertsoftware. Berechnen Sie die Menge in ug jedes Enzym hinzugefügt, um eine Gesamtbelastung von 15 mg / g Glucan zu machen, und dann berechnen die Höhe des jeweiligen Enzyms in ul zu ergänzenjede Reaktion. Generate Excel-Arbeitsblätter Angabe Quelle Laborgeräte, Quelle Brunnen, Ziel-geräte, Ziel Brunnen und Transfervolumen für die Abgabe von Wasser und Enzymen nach dem experimentellen Design und importieren Sie es in der Biomek FXP Software mit dem Transfer-from-Datei-Funktion. 3. Enzymatische Hydrolyse Suspend der Biomasse Gülle in 50 mM Natriumcitrat, pH 4,8, enthält 5 pg / ml Tetracyclin und 5 pg / ml Cycloheximid, in dem Paddel Reservoir. Robotically pipet 200 ul der Gülle in jede Vertiefung einer 96-Well-Deep-Well-Platten mit Reaktion Span-8-1000-ul Pipettenspitzen mit den letzten 0,5 cm abgeschnitten. Mix der Schlamm einmal bei 100 ul / sec und dann absaugen das gleiche Volumen aus dem Paddel Reservoir und verzichten in den Platten. Dispense die Enzyme in die gleiche Platte mit dem Programm in den Beckman FX eingetragen. Seal die Platten mit durchstechbarer CapMats. Invert und tippen Sie aufdie Platten mehrfach zu überwinden Oberflächenspannung. Legen Sie die Platten bei 50 ° C für 48 Stunden in der Hybridisierung Inkubator rotierenden bei 10 Umdrehungen pro Minute. 4. Bestimmung von Glc und Xyl Centrifuge die Reaktion Platten für 3 min bei 1250 xg in einem Ausschwingrotor zentrifugiert. Transfer 100 ul des Überstands in reguläre 96-Well-Platten mit dem AP96 pod des Biomek FX. Die Inkubation bei 90-95 ° C für 10 min, um die Enzyme zu inaktivieren, und dann Zentrifuge bei 1250 xg für 30 sec. Für Glc Messungen, Transfer 12 ul der Überstände in regelmäßigen 96-Well-Platten. Addieren Sie 192 hinzu ul der Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) Reagenz. Die Inkubation bei 50 ° C für 20 min und die Absorbanz bei 510 nm in einem Mikroplatten-Reader. Blank ist Reaktionsgemisch ohne Enzym. Für Xyl Messungen, Transfer 4 ul in 384-Well-Platten. Fügen Sie den Reagenzien des Assays und lesen Sie die Platten bei 340 nm. Leerwird das Reaktionsgemisch ohne Enzym. 5. Data Analysis Konvertieren Sie die Extinktionswerte auf ihre% Glc und Xyl Renditen auf den bekannten Glc und Xyl Inhalt der ursprünglichen Biomasse. Importieren Sie diese Prozentsätze wie die Reaktionen in den Design-Expert-Software. Überprüfen Sie die statistischen Parameter umfassen, um sicherzustellen, dass die Kriterien für eine robuste Modell erfüllt sind. Bestätigen Sie das beste Modell Vorhersage experimentell. 6. Repräsentative Ergebnisse mit GENPLAT: (1) Erstellung von optimierten Mischungen der einzelnen reine Proteine. Die Ergebnisse zeigen, welche Enzyme wichtig sind, und in welchem ​​Verhältnis, und auch die Enzyme sind nicht wichtig. Einige Proteine, die reichlich vorhanden sind in der T. reesei Sekretom (Nagendran et al., 2009), wie Cip1 und Cip2, scheinen keine Rolle in Glc Lüftspiel aus Maisstroh vorbehandelt durch Ammoniak-Faser-Erweiterung (AFEX) oder alkalische hyd rogen Peroxid (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Auf der anderen Seite sind einige Proteine ​​unerwartet wichtig. Zum Beispiel sind Endo-Xylanasen von Glykosylhydrolase Familien 10 und 11 sowohl für Glc Freisetzung wichtig, eine Xylanase kann nicht für die anderen (. Banerjee et al, 2010b, c) zu ersetzen. Cel61A, eine kleine Protein in der T. reesei Sekretom, ist sehr wichtig für Glc aber nicht Xyl freizugeben. Einige Enzyme sind für die Freilassung der beiden Glc und Xyl wichtig, wohingegen andere nur für den einen oder anderen (Banerjee et al., 2010c) sind notwendig. Ein synthetisches Gemisch mit 16 Komponenten, die jeweils in einer Konzentration von 0,94 mg / ml (dh eine nicht-optimierte Mischung), veröffentlicht 38% der verfügbaren Glc von AFEX-vorbehandelte DDG. Unter identischen Bedingungen Hydrolyse, eine optimierte Mischung, in denen die Konzentrationen der 16 Komponenten im Bereich von 0% bis 32%, veröffentlicht 52% der Glc (Abb. 2). Dieses Experiment zeigt den Nutzen der Konstruktion definierte Mischungen. _content "> (2) Schaffung von optimierten Cocktails für unterschiedliche Vorbehandlung / Substrat-Kombinationen. Current kommerziellen Cellulase Präparate sind" one-size-fits-all ". In Wirklichkeit hängt die besten Cocktail-sowohl auf dem Substrat und der Vorbehandlung. Ein einzelnes Produkt wie Accellerase 1000 gibt unterschiedliche Erträge aus verschiedenen Substraten auf die gleiche Weise vorbehandelt, und aus dem gleichen Substrat ausgesetzt unterschiedlichen Vorbehandlungen (Abb. 1). Wir haben GENPLAT verwendet werden, um Mischungen von reinen Enzymen für mehrere Vorbehandlungen und Vielfaches Rohstoffe (Banerjee et optimieren al., 2010c). Abbildung 2 zeigt, wie die optimale Enzym Proportionen von 16 reine Enzyme für AFEX-vorbehandelte Maisstroh, AHP-vorbehandelten Maisstroh und AFEX-vorbehandelte DDG unterscheidet. Nur 11 Enzyme sind in Abb. gezeigt. 2, da die optimale Anteile der übrigen fünf (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 und Cel12A) wurde festgestellt, dass 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) Novel Enzym entdeckt </strong>. Der Bau der optimierten Mischungen aus reinen Proteinen ist ein fortlaufender Prozess. Als neuer Proteine ​​in reiner Form (aus kommerziellen Quellen, durch heterologe Expression oder durch Reinigung) werden, können sie systematisch, indem sie in der aktuellen optimierten geprüft werden. Neuartige Proteine, die an Glc oder Xyl beitragen Release dann Teil einer neuen, optimierten gesetzt werden. Auf diese Weise wird GENPLAT eine Plattform für die Identifizierung neuer Enzyme für Biomasse Dekonstruktion. Wir haben Auszüge aus Pilzen außer T. gemacht reesei und A. niger auf unterschiedlichen Substraten gewachsen. Ein besonderes Extrakt steigerte Glc Ausbeute bei unseren Kern hinzugefügt. Die verantwortliche Protein wurde gereinigt und gezeigt, dass ein Roman Glykosylhydrolase nicht in jeder kommerziellen Enzympräparat (Banerjee und Walton, unveröffentlichte Ergebnisse) werden. (4) Entdeckung der besseren Enzyme. Nachdem mit GENPLAT die Enzyme sind die wichtigsten für den Abbau eines gezeigtinsbesondere Biomasse, haben wir ein besseres Verständnis für die Enzyme der Schwerpunkt für die Verbesserung sein sollte. Bessere Beispiele der kritischen Enzyme könnten durch die Suche in der Natur gefunden werden oder gemacht durch Protein-Engineering. (Ein Enzym könnte "besser" als ihre T. reesei homolog in mehrfacher Hinsicht abhängig von der gewünschten Eigenschaft, sank z. B. höhere spezifische Aktivität, größere Synergie, proteolytische Empfindlichkeit oder eine höhere thermische Stabilität). GENPLAT bietet eine sinnvolle Plattform für die Bestimmung von potentiell bessere Enzyme, weil es eine realistische komplexe Cocktail (wichtig, weil keine Biomasse Enzym arbeitet in Isolation) und eine realistische Substrat (wichtig nutzt, da die Ergebnisse mit reiner Cellulose oder anderen künstlichen Substraten möglicherweise nicht relevant für natürliche Lignozellulose Materialien). (5) Gewerbliche Enzym-Optimierung. Ausreichend große Mengen reiner Enzyme noch nicht in der realen Welt existieren. Bis sie es tun, Ethanol proProduzenten müssen auf kommerzielle Produkte wie Accellerase 1000 und MultifectXylanase verlassen. Allerdings Mischungen von handelsüblichen Enzymen in der Regel besser als jeder einzelne ein, und GENPLAT kann zur optimierten Cocktails von mehreren kommerziellen Enzyme Design. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von GENPLAT um eine Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate optimieren. Die optimale Proportionen für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG wurde festgestellt, dass 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pektinase, 22% Novozyme 188 und 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010c) werden. 3B zeigt die Unterschiede in Glc Ausbeute von AFEX-DDG mit vier Enzympräparate, die optimierte kommerzielle Mischung führt zu einer höheren Rendite als Glc Accellerase1000 allein SpezymeCP allein, oder ein 16-Komponente synthetischen Mischung. Dieses Experiment zeigt auch, dass die 16-Komponente synthetischen Mischung fehlt ein oder mehrere Enzyme für eine optimale Glc Release, das in einem oder mehreren der kommerziellen Enzyme benötigt werden. GENPLAT können unsed zu identifizieren solcher Komponenten. Abbildung 1. Keine einzige kommerzielle Enzympräparation ist optimal für alle Untergründe und alle Vorbehandlungen. Fünf Substrate und drei Vorbehandlungen wurden unter ähnlichen Bedingungen von Schleifen (0,5 mm Korngröße) verglichen, Enzymbeladung (15 mg / g Glucan) und Hydrolysebedingungen (48 h, 50 ° C). A. Verdauung verschiedener AFEX-vorbehandelte Substrate mit Accellerase 1000. B. Verdauung von Maisstroh vorbehandelt durch drei verschiedene Methoden mit Accellerase 1000 (siehe Banerjee et al., 2010c). Abbildung 2. Optimale Proportionen von 11 Enzymen für die Freisetzung von Glc von AFEX-vorbehandelte Maisstroh (AFEX-CS), alkalische Wasserstoffperoxid-vorbehandelte Maisstroh (AHP-CS) oder AFEX-vorbehandelte getrocknete destillierenERS "Körner (AFEX-DDG). Die Daten stammen aus Banerjee et al. (2010c). Die Zahlen entlang der Oberseite der Balken sind die Glc Erträge als prozentualer Anteil der gesamten Glc in der Biomasse Probe. Abbildung 3. A. Die Verwendung von GENPLAT eine optimierte Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG zu produzieren. Multifect Xylanase aus den kleinsten Beitrag (4%) und wurde daher von dieser ternären Diagramm weggelassen. B. Glc Erträge aus AFEX-DDG mit verschiedenen Enzym-Behandlungen unter identischen Bedingungen Hydrolyse (15 mg / g Glucan Enzym, 48 h, 50 ° C) . "Vier-Komponenten-commercial" hat die Proportionen aus dem Experiment in Abb. bestimmt. 3A.

Discussion

Es ist allgemein anerkannt, dass die Senkung der Kosten von Enzymen ist wichtig, die Entwicklung eines wirtschaftlichen Lignocellulose Ethanol-Industrie. Die derzeit verfügbaren kommerziellen Enzym-Cocktails sind komplex und schlecht definierte Mischungen aus vielen Proteinen (Nagendran et al., 2009), und sie sind vorwiegend für den Einsatz auf den Säure-vorbehandelten Maisstroh angepasst. Um die Entwicklung besserer Enzym-Cocktails zu beschleunigen, haben mehrere Labors mit hohem Durchsatz-Plattformen für die Enzym-Entdeckung und Charakterisierung entwickelt. .; Decker et Roboter Abgabe von Enzymen und Biomasse Schlämmen, statistische Design of Experiments, und / oder automatisierten Bestimmung von Glc und Xyl (Berlin et al, 2007: Die Anstrengungen in diesem Bereich eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auch in GENPLAT gefunden eingebaut al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT erweitert diese früheren Bemühungen, die meisten deutlich in der Komplexität der Enzym-Mischungen, die aus maximal 6-Komponenten analysiert werden kann inden früheren Studien an mehr als 16 in unserem neuesten Werk (Banerjee et al., 2010c). Weitere wichtige Merkmale der GENPLAT sind die Verwendung von einem Wulst Mischkammer (Paddel-Reservoir), dass stover Schlämme während der Abgabe der Schwebe zu halten kann; schonende Durchmischung während der Verdauung von end-over-end Rotation und automatisierte kolorimetrischen Bestimmung von Glu und Xyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)