GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

Summary

GENPLAT (רציף GLBRC אנזימים) מהווה פלטפורמה אוטומטיות לגילוי ואופטימיזציה של קוקטיילים אנזים לפירוק ביומסה. זה יכול להיות מותאם ממקורות מרובים תערובות של אנזימים המכילים רכיבים מרובים.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. אנזימים הפקה לייצר חלבונים pastoris Pichia על ידי שיבוט של הגנים המתאימים לתוך וקטורים pPICZ או pPICZα ו והפיכתו פ pastoris. לגדל תאים של 300 מ"ל קבוצות ב -500 מ"ל צלוחיות מבולבל עם אינדוקציה מתנול בכל שעה 24 (Banerjee et al. 2010a). להתרכז desalt filtrates תרבות על ידי סינון תזרים משיק. חנות אנזימים aliquots קטן גליצרול 20% ב -80 ° C. טווח הריכוז הוא 10-10 מ"ג / מ"ל. 2. עיצוב של ניסוי מספר קלט של אנזימים להיבדק, והעליון שלהם בפרופורציות נמוכות (למשל שיעור נמוך יותר של 5% עבור אנזימים הליבה), ואת סוג של תכנון הניסוי (למשל, ריבועית או מעוקב) לתוך Design-Expertsoftware. לחשב את הסכום מיקרוגרם של אנזים זה יתווספו לבצע העמסה הכולל של גלוקן מ"ג / g 15, ולאחר מכן לחשב את כמות האנזים כל μl להוסיףכל תגובה. יצירת גליונות עבודה של Excel labware ציון מקור, מקור בארות, labware היעד, בארות היעד כרכים העברה מחלק מים ואנזימים על פי תכנון ניסויי ולייבא אותו לתוך התוכנה Biomek FXP באמצעות פונקציית העברה מ-file. 3. אנזימתי הידרוליזה להשעות את slurry ביומסה ציטראט 50 מ"מ נתרן, pH 4.8, המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו טטרציקלין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​cycloheximide, במאגר ההנעה. רובוט 200 pipet μl של slurry לתוך היטב כל אחד 96-באר עמוקה, גם באמצעות צלחות התגובה Span-1000-8 μl טיפים pipet עם 0.5 ס"מ האחרונה מנותקת. מערבבים את slurry פעם μl 100 / sec ואז לשאוב באותו נפח ממאגר ההנעה ולחלק לתוך הצלחות. מחלקים את האנזימים לתוך צלחת אותו באמצעות התוכנית נכנסה המט"ח Beckman. חותם את הצלחות עם capmats לנקבה. היפוך והקשהצלחות מספר פעמים להתגבר על מתח הפנים. מקמי את הצלחות על 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות את ההכלאה חממה מסתובב בסל"ד 10. 4. קביעת Glc ו Xyl צנטריפוגה צלחות התגובה דקות 3 XG ב 1250 בצנטריפוגה דלי מתנדנד. העברת 100 μl של supernatant לתוך צלחות 96-היטב קבוע באמצעות תרמיל AP96 של FX Biomek. דגירה צלחות ב 90-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת להשבית את האנזימים, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 1250 למשך 30 שניות. עבור מדידות Glc, להעביר 12 μl של supernatants לתוך 96-היטב צלחות קבוע. הוסף 192 μl של מגיב מונואמין / peroxidase (GOPOD) גלוקוז. דגירה צלחות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולקרוא את absorbances ב 510 ננומטר קורא microplate. בלנק הוא תערובת התגובה עם האנזים לא. עבור מדידות Xyl, להעביר 4 ​​μl לתוך 384 גם הצלחות. מוסיפים את ריאגנטים assay ולקרוא את הצלחות ב 340 ננומטר. ריקהוא תערובת התגובה עם האנזים לא. 5. ניתוח נתונים המר את ערכי ספיגת ל% Glc שלהם תשואות Xyl מבוסס על Glc ידוע תוכן Xyl של ביומסה המקורי. ייבוא ​​אלה אחוזי כתגובות לתוך תוכנת עיצוב-המומחה. בדוק את paramenters סטטיסטי כדי להיות בטוח כי הקריטריונים מודל החזקה מתקיימים. אשר את חיזוי המודל הטוב ביותר בניסוי. 6. תוצאות עם נציג GENPLAT: (1) יצירה של תערובות אופטימיזציה של חלבונים טהורים בודדים. תוצאות המחקר מראות אשר אנזימים חשובים, ובאיזה פרופורציות, וגם אנזימים אשר אינם חשובים. כמה חלבונים בשפע ט reesei secretome (Nagendran et al., 2009), כגון Cip1 ו Cip2, להופיע לשחק שום תפקיד Glc שחרור Stover תירס pretreated על ידי הרחבת אמוניה סיבים (AFEX) או hyd אלקליין רוגן חמצן (AHP) (Banerjee et al. 2010b). מצד שני, כמה חלבונים חשובים באופן בלתי צפוי. לדוגמה, אנדו, xylanases משפחות Hydrolase Glycosyl 10 ו -11 הן חשובות עבור Glc שחרור, אחד xylanase לא יכולה להוות תחליף אחר (Banerjee et al, 2010b, ג.). Cel61A, חלבון קטין ט reesei secretome, חשוב מאוד Glc אך לא Xyl לשחרר. כמה אנזימים חשובים עבור שחרורו של שניהם Glc ו Xyl, בעוד שאחרים נדרשים רק עבור זה או אחר (Banerjee et al. 2010c). תערובת סינתטי המכיל 16 מרכיבים, שכל אחד מהם בריכוז של 0.94 מ"ג / מ"ל ​​(כלומר, תערובת לא אופטימלית), שוחררו 38% Glc זמינים AFEX-pretreated DDG. הידרוליזה בתנאים זהים, תערובת אופטימלית, שבה ריכוזים של 16 רכיבים נע בין 0% ל -32%, שוחררו 52% Glc (איור 2). ניסוי זה ממחיש את התועלת של בניית תערובות מוגדרות. _content "> (2) יצירה של קוקטיילים אופטימיזציה עבור המקדים שונות / שילובים המצע. נוכחי ההכנות cellulase מסחריים הם" אחד בגודל-fits-all ". במציאות, קוקטייל הטובה ביותר תלויה המצע והן המקדים. מוצר יחיד כמו Accellerase 1000 נותן תשואות שונה מצעים שונים pretreated באותה הדרך, ומן המצע אותו חשוף pretreatments שונות (איור 1). השתמשנו GENPLAT כדי לייעל את תערובות של אנזימים טהור pretreatments מרובים feedstocks mutiple (Banerjee et al. 2010c). איור 2 מראה כיצד הפרופורציות האנזים אופטימלי של 16 אנזימים טהור שונה עבור AFEX-pretreated Stover תירס, AHP-pretreated Stover תירס, ו-AFEX pretreated DDG. רק 11 אנזימים מוצגות באיור 2. כיוון אופטימלי הפרופורציות של חמישה אחרים (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 ו Cel12A) נמצאו 0% (Banerjee et al. 2010c). (3) באנזים רומן הגילוי </strאונג>. בניית תערובות אופטימיזציה של חלבונים טהורים הוא תהליך מתמשך. כמו חלבונים חדשים הופכים לזמינים בצורה הטהורה (ממקורות מסחריים, על ידי ביטוי Heterologous, או על ידי טיהור), הם יכולים להיבדק באופן שיטתי על ידי הוספת אותם כדי להגדיר את אופטימלית הנוכחית. חלבונים רומן שתורמים Glc Xyl או לשחרר ואז הופכים לחלק סט חדש, מותאם. בדרך זו, GENPLAT הופכת פלטפורמה לזיהוי של אנזימים חדשים הדקונסטרוקציה ביומסה. עשינו תמציות של פטריות אחר מאשר ט ' reesei וא ניז'ר ​​גדלו על מצעים שונים. אחת לחלץ מסוים שיפרה תשואה Glc כאשר הוסיף להגדיר הליבה שלנו. חלבון זה אחראי היה מטוהרים העולם להיות hydrolase glycosyl רומן לא קיים שום הכנה אנזים מסחרי (Banerjee ו וולטון, התוצאות לא פורסם). (4) גילוי אנזימים טוב יותר. הראינו עם GENPLAT אשר אנזימים הם החשובים ביותר של השפלהביומסה מסוימת, יש לנו הבנה טובה יותר של אנזימים אשר צריך להיות המוקד לשיפור. דוגמאות טובות יותר של האנזימים קריטיים ניתן למצוא על ידי חיפוש בטבע או שבוצעו על ידי הנדסת חלבון. (האנזים יכול להיות "טוב יותר" מאשר homolog ט reesei שלה במספר דרכים, בהתאם הנכס הרצוי, פעילות למשל, ספציפיים יותר, סינרגיה גדולה יותר, ירידה ברגישות proteolytic, או יציבות תרמית משופרת). GENPLAT מספק פלטפורמה משמעותית עבור assaying אנזימים פוטנציאל טוב יותר, משום שהוא מנצל קוקטייל מורכב מציאותי (חשוב כי אין אנזים ביומסה עובד בבידוד) ואת מצע ריאליסטי (חשוב כי התוצאות עם תאית טהורה או מצעים מלאכותיים אחרים לא יכול להיות רלוונטי lignocellulosic טבעי חומרים). (5) אנזים מסחרי אופטימיזציה. כמויות גדולות מספיק של אנזימים טהור עדיין לא קיימים בעולם האמיתי. עד שהם עושים, אתנול הפרוducers להסתמך על מוצרים מסחריים כגון Accellerase 1000 ו MultifectXylanase. עם זאת, תערובות של אנזימים מסחריים בדרך כלל ביצועים טובים יותר מכל אדם אחד, ו GENPLAT ניתן להשתמש כדי לעצב קוקטיילים אופטימיזציה של אנזימים מסחרי מרובים. איור 3 מציג את השימוש GENPLAT כדי לייעל תערובת של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי. הפרופורציות האופטימלי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG נמצאו 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, ו -4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010c). איור 3 ב מציג את ההבדלים בתשואה Glc מ AFEX-DDG עם ארבעה ההכנות אנזים; את התערובת מסחרי מותאם נותן תשואה גבוהה יותר מאשר Glc Accellerase1000 לבד, SpezymeCP בלבד, או תערובת 16-מרכיב סינתטי. ניסוי זה גם מציין כי את התערובת 16-מרכיב סינתטי חסר אחד או יותר האנזימים הדרושים אופטימלי Glc שחרור, אשר נמצאים אחד או יותר של האנזימים מסחרי. GENPLAT ניתן לנועורך לזהות מרכיבים כאלה. באיור 1. ללא הכנה יחיד אנזים מסחרי הוא אופטימלי עבור כל מצעים וכל pretreatments. חמש מצעים ושלושה pretreatments הושוו בתנאים דומים של שחיקה (החלקיקים בגודל 0.5 מ"מ), טוען האנזים (15 מ"ג / g גלוקן), ותנאי הידרוליזה (48 שעות, 50 ° C). A. עיכול של AFEX-pretreated מצעים שונים עם Accellerase 1000. עיכול ב 'של Stover תירס pretreated על ידי שלוש שיטות שונות עם Accellerase 1000 (ראה בנרג'י et al. 2010c). באיור 2. הפרופורציות אופטימלית של 11 אנזימים עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated Stover תירס (AFEX-CS), אלקליין חמצן, מימן pretreated Stover תירס (AHP-CS), או AFEX-pretreated יבשים לזקקERS "דגנים (AFEX-DDG). הנתונים הם מתוך בנרג'י et al. (2010c). מספרים לאורך החלק העליון של הסורגים הם התשואות Glc כאחוז מסך Glc במדגם ביומסה. איור 3 א. השימוש GENPLAT לייצר תערובת אופטימלית של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG. Multifect Xylanase עשה את התרומה הקטנה ביותר (4%) ו – הושמט ולכן מן התרשים הזה משולשת. התשואות ב Glc מ AFEX-DDG עם טיפולים אנזים שונה בתנאים זהים הידרוליזה (15 מ"ג / g אנזים גלוקן, 48 שעות, 50 ° C) . "ארבע מרכיב מסחרי" יש את הפרופורציות נקבע מהניסוי באיור. 3A.

Discussion

הוא זוכה להכרה רחבה, כי הפחתת העלות של אנזימים חשוב בהתפתחות של תעשיית האתנול חסכוני lignocellulosic. כרגע זמין קוקטיילים אנזים מסחריות הן תערובות מורכבות מוגדרת היטב של חלבונים רבים (Nagendran et al., 2009), והם מותאמים בעיקר לשימוש על חומצה pretreated Stover תירס. על מנת להאיץ את הפיתוח של קוקטיילים אנזים טוב יותר, מעבדות כמה פיתחו תפוקה גבוהה פלטפורמות גילוי האנזים ואפיון. המאמצים בתחום זה שילבו אחד או יותר מהמאפיינים הבאים נמצא גם GENPLAT: מחלק הרובוטית של אנזימים slurries ביומסה, עיצוב הסטטיסטית של הניסוי, ו / או קביעה אוטומטית של Glc ו Xyl (ברלין et al, 2007; דקר et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT מרחיב את המאמצים האלה מוקדם יותר, באופן משמעותי ביותר את המורכבות של תערובות האנזים כי ניתן לנתח מן היותר 6 רכיביםמחקרים קודמים יותר מ 16 בעבודה האחרונה שלנו (Banerjee et al. 2010c). תכונות עיקריות נוספות של GENPLAT הן את השימוש של חדר ערבוב חרוז (מאגר ההנעה) שיכולה לשמור slurries סטובר הושעה במהלך מחלק; ערבוב עדין במהלך העיכול על ידי סיבוב קצה מעל הקצה; ונחישות colorimetric אוטומטי של Glu ו Xyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)