Kolorektal cancer cellytan Proteinprofilering Använda en antikropp microarray och fluorescens Multiplexing
Summary
Vi beskrev ett förfarande för uppdelning av kolorektal cancer (CRC) för att producera livskraftiga enskilda celler, som sedan fångas på skräddarsydda antikroppar microarrays erkänna ytantigener (DotScan CRC microarray). Sub-populationer av celler bundna till microarray kan profileras med fluorescens multiplexering använda monoklonala antikroppar märkta med fluorescerande färger.
Abstract
Den nuvarande prognosen och klassificeringen av CRC är beroende av iscensättningen system som integrerar histopatologiska och kliniska fynd. Men i de flesta av CRC fall är cellsdysfunktion resultatet av många mutationer som modifierar protein uttryck och post-translationell modifiering 1.
Ett antal av antigener på cellytan, däribland kluster av differentiering (CD) antigener, har identifierats som potentiella prognostiska eller metastaserad biomarkörer i barnkonventionen. Dessa antigener gör idealisk biomarkörer som deras uttryck som ofta förändras med tumörprogression eller interaktioner med andra celltyper, såsom tumör-infiltrera lymfocyter (TILs) och tumör-associerade makrofager (TAMs).
Användningen av immunohistokemi (IHC) för cancer sub-klassificering och prognostisering är väl etablerad för vissa tumörtyper 2,3. Dock har ingen enda "markör" visas prognostisk betydelse är större än klinisk-patologisk staging eller vunnit stor acceptans för användning i rutinmässig patologi rapportering av alla CRC fall.
En nyare metod för prognostiska skiktning av sjukdom fenotyper bygger på profiler ytprotein använder flera "markörer". Medan expression profiling av tumörer med hjälp av proteomik tekniker såsom iTRAQ är ett kraftfullt verktyg för upptäckten av biomarkers4 är det inte optimalt för rutinmässig användning i diagnostiska laboratorier och kan inte skilja olika celltyper i en blandad befolkning. Dessutom finns stora mängder tumörvävnad krävs för profilering av renat glykoproteiner plasmamembranet av dessa metoder.
I denna video har vi beskrivit en enkel metod för utanpåliggande proteom profilering av livskraftiga celler från uppdelad CRC prover med en DotScan CRC antikropp microarray. Den 122-antikropp microarray består av en standard 82-antikropp regionen att erkänna en rad släkt-specifika leukocyter markörer, adhesionsmolekyler, receptorer och markörer för inflammation och immunsvar 5, tillsammans med en satellit region för detektion av 40 potentiellt prognostiska markörer för CRC . Celler fångas endast på antikroppar som de uttrycker motsvarande antigen. Den celltäthet per punkt, bestäms av optisk avläsning, återspeglar andelen celler som uttrycker att antigen, nivån av uttryck av antigen och affinitet av antikroppen 6.
För CRC vävnad eller normala tarmslemhinnan, optiska skannar återspeglar immunofenotyp av blandade populationer av celler. Fluorescens multiplexering kan sedan användas för att profilera utvalda sub-populationer av celler av intresse fångas på matrisen. Till exempel Alexa 647-anti-epitelceller celladhesionsmolekyl (EpCAM, CD326) är en pan-epitelial differentiering antigen som användes för att upptäcka barnkonventionen celler och även epitelceller av normal tarmslemhinnan, medan Phycoerythrin-anti-CD3, användes att upptäcka infiltrera T-celler 7. Den DotScan CRC microarray bör vara prototyp för ett diagnostiskt alternativ till de anatomiskt baserade CRC staging system.
Protocol
Discussion
I denna video visar vi hur DotScan antikropp microarray kan användas i en enkel, semi-kvantitativa sätt att studera profiler ytantigen för cellpopulationer från CRC vävnad.
Skaffa en livskraftig enda cell avstängning från vävnad är avgörande för framgång i försöket, eftersom energi-beroende processer (t ex, antigen ett tak och / eller pseudopodia bildning) verkar krävas för fasta bindning av hela celler till antikropp prickar under inkubationen, samtidigt som döda celler dä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar personalen på Anatomiska patologi Laboratories i Royal Prince Alfred och Concord Sjukhus Repatriering för insamling av färska prover av barnkonventionen och normala tarmslemhinnan. Arbetet har finansierats av en Cancer Institute i New South Wales Translationell Program Grant.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
Referências
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed, ., et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
