संयंत्रों में देखिए का सटीक स्थानीयकरण के लिए स्वस्थानी संकरण में

Summary

<em> बगल में</em> संकरण यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल और उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ सेलुलर स्तर पर छोटे आरएनए mRNA अभिव्यक्ति का एक सीधा स्थानीयकरण की अनुमति देता है. प्रक्रिया आयल एम्बेडेड प्लान्ट टिशू वर्गों के लिए अनुकूलित है, पौधों और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है, और दस दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है.

Abstract

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks^1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting^4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene’s expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types.

Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest.

Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs^8-14.

Protocol

1. नमूना तैयार नोट: सभी अप करने के लिए और कदम सहित संकरण कदम RNase गतिविधि के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए यह साफ परिस्थितियों में काम करने के लिए आवश्यक है. यह भी काफी आम है सब समाधान RNase मुक्त कम से कम 3 घंटे के लिए DEPC इलाज पानी कांच के बने पदार्थ और 180 पर बेक्ड ° सी का उपयोग करके बनाने के. प्लास्टिक कंटेनर अक्सर 0.2 एन NaOH के साथ 30 मिनट के लिए उपचार के माध्यम से साफ कर रहे हैं. हालांकि, इन सावधानियों के कोई भी आवश्यक हैं और हम आम तौर पर सभी समाधान के लिए नियमित रूप से साफ milliQ एच 2 हे का उपयोग. हम सीटू hybridizations के लिए अलग अभिकर्मकों, बक्से और कांच के बने पदार्थ रखने और एक साफ कैबिनेट में इन दुकान. नमूना निर्धारण दिन 1: ताजा 4% paraformaldehyde लगानेवाला (पीएफए) तैयार करें. के लिए 500 मिलीलीटर, गर्म 400 मिलीलीटर 1x से 60 पीबीएस (130 मिमी NaCl, 7 मिमी ना 2 HPO 4, 3 2 नाह पीओ 4 pH7.0 मिमी) सी और NaOH के दो छर्रों भंग °. एक धूआं हुड में, paraformaldehy के 20 ग्राम जोड़ेंडे और मिश्रण अच्छी तरह से जब तक भंग. बर्फ पर समाधान प्लेस और जब 7,2 करने के लिए एच 2 अतः 4 (100ml के लिए 1-2 बूँदें) के साथ पीएच को समायोजित ठंडा. फिर 1x पीबीएस के साथ 500 एमएल मात्रा समायोजित करें. नोट: एचसीएल उपयोग पीएच को समायोजित के रूप में इस अत्यधिक जहरीले धुएं जारी करेंगे मत करो. Paraformaldehyde विषैला होता है, इसलिए इस समाधान से एक धूआं हुड में तैयार किया जाना चाहिए और ठीक से निपटाया. इसके अलावा, Paraformaldehyde 4 ° C में संग्रहीत किया जाता है और नए हर 6 खरीदा जाना चाहिए – 9 महीने. फसल काटने वाले ऊतकों के नमूनों और उन्हें तुरंत बर्फ पर कांच जगमगाहट शीशियों में 15 एमएल ताजा पीएफए ​​लगानेवाला में जगह. यदि ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता है, यह सबसे अच्छा ठंड लगानेवाला में बर्फ पर किया जाता है. नोट: यह लगानेवाला के एक बड़े अतिरिक्त का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य सिफारिश अनुपात करने के लिए ऊतक के 1 मात्रा लगानेवाला के 10 संस्करणों का उपयोग करने के लिए है. जबकि बर्फ पर नमूने के लिए एक वैक्यूम (~ 500 मिमी Hg) लागू करें. 15-20 मिनट के लिए एक वैक्यूम पकड़ो, छोटे बुलबुले नमूना से जारी करना चाहिएलेकिन लगानेवाला एक फोड़ा करने के लिए नहीं आना चाहिए. वैक्यूम रिलीज धीरे धीरे, और पीएफए ​​लगानेवाला को नवीनीकृत करने के लिए सुनिश्चित करें लगानेवाला सही एकाग्रता में रहता है. इस चरण को दोहराएँ जब तक ऊतकों निर्वात की रिहाई के बाद सिंक. नोट: फिक्सेशन तय करने के लिए और पार से लिंक ऊतक के भीतर शाही सेना अणु की आवश्यकता है. यह कदम महत्वपूर्ण है खराब तय सामग्री के रूप में एक कम संकेत उपज. कुछ ऊतकों तुरंत सिंक नहीं है, लेकिन सबसे अंत में रातोंरात डूब जाएगी. लगानेवाला की घुसपैठ में सुधार करने के लिए, निम्नलिखित डिटर्जेंट जोड़ा जा सकता है: ट्राइटन 0.1% और / या 0.1 से बीच – 0.3%. वैकल्पिक रूप से, formaldehyde शराब अम्लीय एसिड (FAA) जैसे इथेनॉल आधारित fixatives, ऊतकों कि अन्यथा 14,15 आसानी से नहीं घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीएफए ​​लगानेवाला एक बार और बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर शीशियों रखना. ऊतक एम्बेडिंग 2 दिन: पूर्व शांत 1x पीबीएस और इथेनॉल श्रृंखला 4 डिग्री सेल्सियस नमूने टीडब्लूआइ कुल्ला30 1x पीबीएस में प्रत्येक बर्फ पर मिनट, के लिए CE. नोट: फिर यह प्रत्येक समाधान के एक बड़े अतिरिक्त का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. उन्हें एक श्रृंखला के माध्यम से इथेनॉल ले, पालन के रूप में बर्फ पर नमूने निर्जलीकरण: 10% इथेनॉल 30 मिनट, 30% इथेनॉल 30 मिनट, 50% इथेनॉल 1 घंटा, 70% इथेनॉल 1 घंटा, 85% इथेनॉल 1 घंटा, 95% इथेनॉल 1hour, 3 प्रत्येक 1hour के लिए 100% इथेनॉल परिवर्तन दिन के अंत में, 0.1% Eosine से 100% इथेनॉल इथेनॉल रात भर की जगह 4 में डिग्री सेल्सियस Eosine दाग कोशिका दीवार नमूने अधिक एम्बेड और सेक्शनिंग के दौरान दिखाई. नोट: बार यहाँ संकेत दिया 3x3x3 मिमी लेकिन अब incubations बड़े नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है है के ब्लॉक के लिए अनुकूलित किया गया है. नमूने 4 ° C पर 70% इथेनॉल में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. </li> 3 दिन: निम्नलिखित सुबह, एक घंटे के लिए कमरे के तापमान के लिए नमूने गर्म. फिर धीरे – धीरे इथेनॉल निम्नानुसार histoclear के साथ प्रतिस्थापित: दिन के अंत में, Paraplast प्लस चिप्स के 1 / 4 मात्रा को जोड़ सकते हैं और एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में शीशी जगह. इसके अलावा Paraplast चिप्स के साथ एक बीकर भरने और इस बार फिर से भरना क्रम में करने के लिए हमेशा हाथ में हौसले से पिघला हुआ मोम. नोट: ओवन का तापमान 60 ऊपर Paraplast महत्वपूर्ण और लंबे समय तक हीटिंग ° सी बचा जाना चाहिए. दिवस 4: धीरे – धीरे नियमित रूप से अधिक आयल चिप्स (हर घंटे) जोड़कर Paraplast के साथ histoclear की जगह. दिन के अंत में, ध्यान से बंद histoclear / मोम मिश्रण डालना और तुरंत यह शुद्ध पिघला हुआ मोम के साथ जगह. नमूनों में 60 डिग्री सेल्सियस रातोंरात छोड़ो. 5 दिन और 6: Paraplast 3 बार दैनिक बदलें, हर 4 घंटे के बारे में ताजा पिघला हुआ मोम के साथ एस रखने,amples पर 60 डिग्री सेल्सियस नोट: यह संभव है मोम एक दिन केवल एक बार बदल, लेकिन ऊतक तैयारी कुछ अतिरिक्त दिन लेने के लिए पूरा होगा, के रूप में मोम के लिए कम से कम 5 या 6 बार बदलने की जरूरत है. ऊतकों के नमूनों की वैक्यूम घुसपैठ जब इन 100% EtOH और / या मोम में आगे घुसपैठ और ऊतकों के एम्बेडिंग में सुधार कर सकते हैं. वैक्यूम मोम में नमूनों की घुसपैठ 60 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए 7 दिन: मोम अधिक एक बार बदलें. histoclear की गंध अब पूरी तरह से चला जाना चाहिए और नमूने बाद में उस दिन एम्बेडेड कर सकते हैं. 60 में एक बड़ी वार्मिंग की थाली सेट · सी एल्यूमीनियम पन्नी के द्वारा संरक्षित है. एम्बेडिंग की विधि विश्लेषण ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. इस कदम पर सबसे महत्वपूर्ण बात करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूने बाद सेक्शनिंग करने के लिए सही ढंग से उन्मुख होते हैं. एक तरह से प्लास्टिक molds और अंगूठियां का उपयोग करने के लिए है. गर्म वार्मिंग थाली पर molds और मोल्ड के नीचे के भाग में पिघला हुआ मोम डालना. स्थानांतरणइच्छित स्थिति में गरम संदंश और यह उन्मुख के साथ मोल्ड में एक ऊतक का नमूना. मोल्ड पर सफेद अंगूठी प्लेस और अतिरिक्त पिघला हुआ मोम जैसे कि ऊतकों पूरी तरह से कवर कर रहे हैं जोड़ने. ध्यान से थाली से बेंच मोल्ड चाल है. चलो मोम नीचे धीरे – धीरे शांत. एक और संभावना के लिए एक पेट्री डिश में सभी नमूने युक्त पिघला हुआ मोम (नमूने पूरी तरह से मोम के द्वारा कवर किया जाना चाहिए), जबकि 60 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर काम कर वितरित करने के लिए है. गर्म संदंश के साथ नमूने की ओर मालूम. अंत में, थाली बंद स्विच. जब मोम जम जाता है, पेट्री डिश बेंच के लिए ले जाया जा सकता है और फिर 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस जब सेक्शनिंग के लिए तैयार, छोटे ब्लॉकों एक ऊतक का नमूना युक्त पेट्री डिश के बाहर कटौती कर सकते हैं और एक गर्म ब्लेड के साथ पिघला हुआ मोम की एक अतिरिक्त बूंद के साथ एक सूक्ष्म तक्षणी नमूना धारक पर घुड़सवार. सेक्शनिंग से पहले कुछ मिनट के लिए नमूना कठोर चलो. नोट: ब्लॉक कर सकते हैं4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस 1 वर्ष या उससे अधिक समय के लिए. अतिरिक्त ऊतक नियतन और एम्बेडिंग पर उपयोगी टिप्स के लिए, रेफरी देखें. 16 2. जांच की तैयारी क्लोनिंग जांच आमतौर पर हित के जीन की एक या अधिक विशिष्ट क्षेत्रों को उत्पन्न कर रहे हैं. अति दोहराव दृश्यों जांच से बाहर रखा जाना चाहिए, लेकिन प्रतिलेखन कारकों में डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों के रूप में संरक्षित प्रोटीन डोमेन, इसी अनुक्रम आमतौर पर विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न 8,9,12,15 (1 छवि) निकलेगा. यह है क्योंकि बाद संकरण के चरणों में इलाज RNase (नीचे देखें) जांच जीन परिवार के सदस्यों के बीच क्रॉस – संकरण के स्तर को कम कर देता है. RNase शाही सेना duplexes में बेमेल पर एक cleaves, fragmenting अपूर्ण है complementarity है, जो बाद के चरणों में धोया जाएगा के साथ टेप को संकरित जांच. सामान्य में, कई जांच करने के लिए ब्याज की प्रत्येक जीन के लिए परीक्षण किया जा आवश्यकता हो सकती है. जांच के रूप में लंबाई में 150 ठिकानों के रूप में कम किया जा सकता है. Althougघंटे जांच की लंबाई के लिए कोई सीमा नहीं है, छोटे टुकड़े तो 1.5 केबी आम तौर पर बेहतर टाइप करना. T3, T7, या SP6 प्रमोटरों (जैसे pCRII Topo, Invitrogen) युक्त वेक्टर में डीएनए टुकड़े करने के लिए लिखित जा क्लोन हैं. वैकल्पिक रूप से, T3 T7, या SP6 प्रमोटर अनुक्रम रिवर्स जांच क्षेत्र amplifying के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर पर 5'-पूंछ के रूप में शामिल किया जा सकता है. हर स्वस्थानी संकरण प्रयोग में में, हम जिसके लिए संकरण पैटर्न में जाना जाता है और जो लगातार काम करता है एक सकारात्मक नियंत्रण जांच, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1D और एच ) शामिल हैं. बाद एक यादृच्छिक शाही सेना जांच कि ब्याज के ऊतकों में किसी भी टेप करने के लिए नहीं संकरण के लिए जाना जाता है हो सकता है. हालांकि यह विश्लेषण के तहत जीन की भावना जांच का उपयोग करने के लिए आम है, यह आवश्यक नहीं है और किसी भी गैर hybridizing शाही सेना उद्देश्य के अनुरूप होगा. यदि उपलब्ध है, हित के जीन की एक transcriptional अशक्त एलील से ऊतकों एक उत्कृष्ट नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे. <li> इन विट्रो प्रतिलेखन में प्रतिबंध एंजाइम है कि प्रमोटर की साइट विपरीत डालने के अंत में हज़म के साथ लगभग 5 μg डीएनए पचाने प्लाज्मिड Linearize. प्रतिबंध एंजाइमों कि एक 3'-अधिकता छोड़ नहीं का उपयोग करें. यह प्रतिलेखन कलाकृतियों के लिए नेतृत्व क्योंकि पोलीमरेज़ एक सब्सट्रेट के रूप में 3 'की अधिकता का उपयोग करने के लिए प्रतिलेखन जारी रख सकते हैं कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, पीसीआर जांच T3 T7, या SP6 प्रमोटर सहित क्षेत्र परिलक्षित हो में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न कर सकते हैं. एक जेल पर एक विभाज्य करने के लिए सत्यापित करें कि प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए चला गया है की जाँच करें. क्लोरोफॉर्म / phenol के साथ डीएनए निकालें, इथेनॉल के साथ वेग और 1μg/μl के एक एकाग्रता के लिए milliQ एच 2 हे में डीएनए गोली resuspend. वैकल्पिक रूप से, डीएनए मानक डीएनए शुद्धि स्तंभों का उपयोग कर साफ किया जा सकता है. मिश्रण द्वारा इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में सेट करें: 1μl पुrified डीएनए (1μg/μl) 2μl 10x प्रतिलेखन बफर 2 μL 10x डीआईजी शाही सेना लेबलिंग मिश्रण 1μl बाहर RNase 2μl T3 T7, या SP6 आरएनए पोलीमरेज़ (20 यू / μl) एच 2 20μl के लिए हे. 37 में सेते ° सी 1 से 2 घंटे के लिए. बाद में एक जेल पर विश्लेषण 1μl रखें. नोट: प्रतिदीप्ति – लेबल जांच जानवर प्रणाली में पसंद कर रहे हैं, लेकिन सबसे संयंत्र के ऊतकों के कारण ऑटो प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल संयंत्रों के लिए, उच्च radiolabeled जांच 17 या अधिक सामान्यतः डीआईजी लेबल जांच जो immunohistochemistry द्वारा पता चला रहे हैं का उपयोग करें. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया 75 μL MilliQ एच 2 हे और 5 μL RQ1 DNase (1 यू / μl) जोड़ने और 37 ° 10 मिनट के लिए सी पर प्रतिक्रिया incubating द्वारा डीएनए टेम्पलेट निकालें. में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया शुद्ध गैर शामिल nucleotides और छोटे टेप को समाप्त . एक possiसाख मिनी त्वरित स्पिन आरएनए कॉलम (Roche) के रूप में एक आकार अपवर्जन Sephadex ® स्तंभ, का उपयोग करने के लिए है. वैकल्पिक रूप से, प्रतिलेखन प्रतिक्रिया एक पारंपरिक वर्षण / LiCl इथेनॉल (रेफरी देख 14.) के द्वारा शुद्ध किया जा सकता है है. एक जेल पर बाद में जाँच 1μl रखें. लंबाई में 250 ठिकानों पर जांच आमतौर पर आंशिक रूप से लगभग 150 NT और इसलिए काफी छोटे कुशलता ऊतक वर्गों घुसना की शाही सेना अणु प्राप्त hydrolized. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया शुद्ध और 60 में सेते डिग्री सेल्सियस 2x कार्बोनेट बफर के एक बराबर मात्रा (80 मिमी NaHCO 3, 120 मिमी ना 2 3 सीओ) जोड़ें ऊष्मायन समय निम्न सूत्र से गणना की जानी चाहिए: = समय (ली वामो) / (कश्मीर एक्स ली वामो एक्स) जहां ली = प्रारंभिक जांच लम्बाई (केबी में), वामो = अंतिम जांच लंबाई (0.150 केबी), कश्मीर = 0.11 केबी / मिनट. एक जेल पर जांच 2 μL रखें. 10% एसिटिक एसिड के 1 / 20 मात्रा जोड़कर hydrolysis प्रतिक्रिया बेअसर. जांच तो है पुरी(100mg/ml) 1 / 10 मात्रा 3M राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद पीएच 5.2 से अधिक 2.5 संस्करणों ठंड 100% इथेनॉल tRNA, 1μl जोड़ने, और 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा fied. 20 मिनट के लिए 4 पर 13,500 rpm डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा शाही सेना वेग सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70 500μl% इथेनॉल के साथ शाही सेना गोली कुल्ला. फिर से अपकेंद्रित्र, गोली शुष्क हवा (आमतौर पर के बारे में 15 मिनट), और 50μl 50% विआयनीकृत formamide में शाही सेना resuspend. जांच -80 ° उपयोग पर जब तक सी संग्रहित किया जाना चाहिए. एक नियमित रूप से 1% पर TAE agarose 2.2.4 वर्गों, 2.2.6 और 2.2.7 (चित्रा 2A) से मध्यवर्ती उत्पादों के रूप में अंतिम उत्पाद के रूप में अच्छी तरह से जेल की जाँच करें. यह इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में की दक्षता की निगरानी की अनुमति देता है. नोट: इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में टेम्पलेट के 1 μg प्रति शाही सेना के लगभग 1 μg उपज चाहिए . डॉट ब्लाट विश्लेषण जांच एकाग्रता और डीआईजी-UTP समावेश डॉट धब्बा विश्लेषण (चित्रा 2B) के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. सीरियल आरएनए dilutions ज्ञात एकाग्रता की एक लेबल नियंत्रण शाही सेना के साथ – साथ एक मानक संकरण झिल्ली पर देखा जाता है. उदाहरण के लिए, हम का उपयोग डीआईजी-UTP लेबल नियंत्रण शाही सेना जांच में इन विट्रो प्रतिलेखन किट (Roche) में शामिल हैं. यह सबसे अच्छा है हर जांच के लिए कई dilutions परीक्षण करने के लिए एक सटीक एकाग्रता स्थापित. 70 पर 1x टीबीएस बफर ° C (100 मिमी pH7.5 Tris – एचसीएल, 150 मिमी NaCl) में अवरुद्ध अभिकर्मक के 0.5% भंग द्वारा अवरुद्ध बफर तैयार है, तो समाधान कमरे के तापमान को शांत करते हैं. एक एन पर इन विट्रो में लिखित और नियंत्रण जांच + नायलॉन झिल्ली के धारावाहिक dilutions (आमतौर पर 10 -1 -5 10) स्पॉट 1μl. यूवी पार से जोड़ने के द्वारा शाही सेना को ठीक करें. नोट: झिल्ली के एक न्यूनतम सतह के बाद जरूरत बफ़र्स की मात्रा को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. समभार बनाना एक मिलाते हुए मंच पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 1x टीबीएस में झिल्ली. झिल्ली ब्लॉक अवरुद्ध का उपयोगएक मिलाते हुए मंच पर आरटी पर 30 मिनट के लिए बफर. 5 मिनट के लिए 1x टीबीएस में झिल्ली कुल्ला. विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं, 1x टीबीएस के 10 मिलीलीटर में विरोधी digoxigenin एपी के 1μl आरटी पर 45 मिनट के लिए गिराए. 1x टीबीएस में दो बार 15 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली धो लें. 5 मिनट के लिए 1x तमिलनाडु बफर (100mm Tris – एचसीएल 9.5 पीएच, 100mm NaCl) में झिल्ली समभार बनाना. एनबीटी / BCIP 1 / 50 (v / v) के साथ 1x तमिलनाडु बफर में incubating झिल्ली दाग. धुंधला 5-10 मिनट ले सकते हैं. बाद में पानी से कुल्ला झिल्ली; यह तो सूख जा सकता है एक रिकार्ड के रूप में रखा. नोट: एनबीटी / BCIP क्षारीय विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी कि hydrolysis पर एक गहरे नीले रंग की डाई उत्पादन संयुग्मित फॉस्फेट के लिए एक सब्सट्रेट है. 3. सेक्शनिंग कमरे के तापमान को गर्म ब्लॉक. यदि ब्लॉक भी ठंडे हैं, अलग अलग वर्गों पर एक मोम रिबन 'के गठन के बिना रोल हो सकता है. एक trape में ब्लॉक छाँटोzoid आकार मोम की 1mm के बारे में नमूना के आसपास जा. एक बड़े स्लाइड गर्म 35-37 पर गर्म डिग्री सेल्सियस नोट: कई प्रोटोकॉल 42 पर इस कदम डिग्री सेल्सियस लेकिन 35-37 के लिए तापमान को कम करने डिग्री सेल्सियस धाराओं के तहत बुलबुले के गठन से बचाता है. ऐसी है कि अब दो समानांतर चेहरे के तल पर है सूक्ष्म तक्षणी पर ब्लॉक रखें. ध्यान ब्लॉक आगे ब्लेड और लाने के लिए सुनिश्चित करें कि ब्लॉक की सतह को ब्लेड समानांतर है. 8 के एक मोटाई पर धारा – 10μm. मोम रिबन एल्यूमीनियम पन्नी या फिल्टर पेपर के रूप में एक गैर चिपचिपा सतह, पर गठबंधन किया जा सकता है ब्याज की वर्गों का चयन करने के लिए. यह एक पास विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. नोट: ऊतक के लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना एक संकेत है चाहे ऊतकों को ठीक किया गया है एम्बेडिंग के दौरान घुसपैठ प्रदान करता है. यदि ब्लॉक के केंद्र लाल भामसान रंग के साथ दाग नहीं है यह आम तौर पर इंगित करता है कि ऊतक खराब तय हो गई है. पर प्लस sl जांच में चिह्नितइडस एक पेंसिल (सबसे पेन या मार्कर के दौरान स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में धुल जाते हैं) और उस पर स्वच्छ milliQ एच 2 हे 1ml वितरित के साथ . ध्यान से कमरे के तापमान (यह पानी पर वर्गों में हेरफेर करने के लिए आसान है जब कमरे के तापमान पर काम कर रहे हैं) पर पानी की सतह पर ब्याज की वर्गों नाव. सुनिश्चित करें कि चमकदार पक्ष (नीचे की ओर के रूप में रिबन सूक्ष्म तक्षणी बंद आता) पानी चेहरे. फिर गर्म स्लाइड पर स्लाइड धीरे हस्तांतरण. ताप वर्गों पानी की सतह पर फैल के लिए मदद करता है. 5 मिनट के बाद बंद पानी सावधानी लेकिन एक चिकनी आंदोलन में डाल, तो रिबन नीचे स्लाइड पर उतारा है. 37 में कम से कम कई घंटे या रात भर के लिए सूखी स्लाइड्स ° सी, तो ऊतक का पालन करता है. नोट: sectioned ऊतक 4 में एक सप्ताह के लिए कुछ दिनों ° C के लिए सिलिका desiccant के साथ एक बॉक्स में संग्रहीत किया जा सकता है है, तथापि, यह सबसे अच्छा है जितनी जल्दी हो सके करने के लिए स्लाइड्स का उपयोग. 4. सीटू हाइब्रिड मेंization पूर्व – उपचार धारा प्रत्येक समाधान के लिए आवश्यक मात्रा जाहिर इलाज और कंटेनर आकार इस्तेमाल किया स्लाइड्स की संख्या पर निर्भर करेगा. वर्गों को हमेशा पूरी तरह से जलमग्न होना चाहिए. एक रैक 25 स्लाइड है और एक बड़े करीने से फिटिंग कंटेनर के लिए, 200-250 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त है. क्योंकि ऊष्मायन कदम के कई बहुत ही कम हैं, हम आम तौर पर सभी संभव समाधान पहली बार तैयार है और तब स्लाइड – पूर्व उपचार शुरू. हालांकि, एसिटिक एनहाइड्राइड समाधान के लिए तुरंत तैयार हो पहले उपयोग और protease उपयोग के समय में जोड़ा है की आवश्यकता होगी. कमरे के तापमान पर सभी चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक अन्यथा नोट. इसके अलावा, सभी buffers के एक शेयर के समाधान के रूप में 10x एकाग्रता में तैयार किया जा सकता है. कंटेनर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म protease बफर (100 मिमी Tris 8.0 पीएच, 50 मिमी EDTA) Deparaffinize और rehydrate ऊतक वर्गों निम्नानुसार है: histoclear – 10 मिनट (एक गिलास पकवान का उपयोग करें) histoclear – 10 मिनट (एक का उपयोग करेंगिलास पकवान) 100% इथेनॉल – 1 मिनट 100% इथेनॉल – 30 सेकंड 95% इथेनॉल – 30 सेकंड 85% इथेनॉल – 30 सेकंड 70% इथेनॉल – 30 सेकंड 50% इथेनॉल – 30 सेकंड 30% इथेनॉल – 30 सेकंड 10% इथेनॉल – 30 सेकंड milliQ एच 2 हे मिनट – 1 2 मिनट के लिए 1x पीबीएस में सेते हैं. 250 मिलीलीटर protease बफर पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस और 37 पर 20 मिनट के लिए स्लाइड्स को सेते डिग्री सेल्सियस में protease 50mg/ml के 625μl मिक्स नोट: protease तय प्रोटीन को पचाने के लिए और जांच सेलुलर RNAs के लिए उपयोग में वृद्धि के लिए आवश्यक है. यह ऊष्मायन के समय को नियंत्रित करने के लिए ऊतक के टूटने के बिना संकरण संकेत को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार कुछ अनुकूलन प्रत्येक ऊतक का नमूना के लिए आवश्यक हो सकता है. 2 मिनट के लिए 0.2% ग्लाइसिन में 1x पीबीएस में protease गतिविधि बेअसर. स्लाइड्स 2 मिनट के लिए 1x पीबीएस में एक बार कुल्ला. स्लाइड्स मैं समझोn 4% पीएफए ​​समाधान 10 मिनट के लिए शाही सेना है जो protease उपचार द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है है फिर से ठीक है. स्लाइड्स दो बार प्रत्येक दो मिनट के लिए 1x पीबीएस में कुल्ला. जबकि स्लाइड्स पीबीएस में हैं washes, 236.25 मिलीलीटर milliQ एच 2 हे में 2M triethanolamine के 12.5 मिलीग्राम (100ml milliQ एच 2 हे में 29.8g, pH8.0 एचसीएल के साथ) के मिश्रण से 0.1 एम triethanolamine समाधान पीएच 8.0 की 250 मिलीलीटर एक गिलास पकवान में. Triethanolamine बफर में 1.25 मिलीलीटर एसिटिक एनहाइड्राइड तुरंत में स्लाइड्स डालने से पहले, जोड़ें और अच्छी तरह से हलचल. स्लाइड्स जोड़ने के बाद, धीरे धीरे 10 मिनट के लिए हलचल जारी है. यह जरूरी है कि स्लाइड रैक triethanolamine / एसिटिक एनहाइड्राइड के कंटेनर में ऊपर उठाया है. हम समर्थन स्टैंड के साथ एक clamping प्रणाली का उपयोग करें. नोट: इस चरण में, सकारात्मक आरोप लगाया एमिनो समूहों है कि गैर विशिष्ट जांच के बंधन को जन्म दे सकती acetylated हैं. इसके अलावा, एसिटिक एनहाइड्राइड विषैला होता है, इसलिए इस समाधान से एक धूआं हुड में तैयार किया जाना चाहिए और ठीक से निपटाया <./ Li> स्लाइड्स 2 मिनट के लिए 1x पीबीएस में दो बार कुल्ला. ऊतक वर्गों फिर निर्जलीकरण: एच 2 हे – 1 मिनट 10% इथेनॉल – 30 सेकंड 30% इथेनॉल – 30 सेकंड 50% इथेनॉल – 30 सेकंड 70% इथेनॉल – 30 सेकंड 85% इथेनॉल – 30 सेकंड 95% इथेनॉल – 30 सेकंड 100% इथेनॉल – 30 सेकंड 100% इथेनॉल – 30 सेकंड नोट: स्लाइड्स तल पर एक 100% इथेनॉल के कई घंटे तक के लिए छोटी राशि के साथ एक कंटेनर में 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस संकरण 85 सी. सेंटीग्रेड के एक हीटिंग ब्लॉक गर्म संकरण बफर तैयार. स्वस्थानी संकरण लवण में एक फाल्कन ट्यूब 1.25 मिलीलीटर (3M NaCl, 100mm Tris – एचसीएल 8.0 पीएच, 100mm ना pH6.8 फास्फेट, 50mm EDTA) में 10 मिलीलीटर का मिश्रण, के लिए, 5 मिलीलीटर विआयनीकृत formamide, 2.5 मिलीलीटर 50% Dextran सल्फेट, 250 μl 50x Denhardt, 125 μl 100mg/ml tRNA, और 875 μl एच 2 ओ <br /> नोट: Dextran सल्फेट बहुत चिपचिपा है, तो यह पहले से गरम करना करने के लिए 60 के लिए सबसे अच्छा समाधान है डिग्री सेल्सियस pipetting के लिए आसान बनाने. संकरण बफर -20 डिग्री सेल्सियस की दुकान में जा सकता है विभिन्न जांच की तैयारी. प्रत्येक स्लाइड के लिए, 9 μl milliQ एच 2 हे और 10 μl विआयनीकृत formamide के साथ 1 μl जांच मिश्रण. 85 पर जांच हीट ° 2-3 मिनट के लिए सी, बर्फ, अपकेंद्रित्र, संक्षिप्त, और 80μl स्लाइड प्रति संकरण बफर जांच जोड़ने पर तुरंत ठंड. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स, लेकिन बुलबुले बनाने से बचें. नोट: जांच की राशि प्रति स्लाइड जोड़ा जा empirically परीक्षण किया जाना चाहिए. आम तौर पर, जांच 0.5 एनजी / केबी / μl जांच जटिलता का एक अंतिम एकाग्रता में उपयोग किया जाता है. चूंकि hybridizations स्लाइड प्रति 100 μl के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, जांच के लगभग 25 एनजी स्लाइड प्रति जांच जो लंबाई और कि 1-केबी लंबे जांच के लिए 50 स्लाइड प्रति जांच की एनजी में 0.5 केबी के लिए की जरूरत है. सादगी के लिए, हम अक्सर 0.5, 1 की कोशिश करो, और 4 स्लाइड प्रति μl जांच. एक पर स्लाइड्स रखेंसतह को साफ करें और उन्हें हवा 5-10 मिनट के लिए पूरी तरह से सूखे. Pipet / जांच संकरण स्लाइड के ठीक किनारे पर बफर मिश्रण. धीरे – धीरे स्लाइड पर एक coverslip कम, सुनिश्चित करें कि संकरण समाधान किसी भी बुलबुले के बिना सभी वर्गों को शामिल किया गया. अपनी उंगली जहां बुलबुले उन्हें ऊतक के सभी वर्गों से विस्थापित फार्म के साथ coverslip हल्के ठोकर. खींच कवर बंद पर्ची के रूप में इस वर्गों नुकसान होगा मत करो. नोट: आमतौर पर इस कदम के लिए प्रयोग किया जाता है एक वैकल्पिक विधि को दो स्लाइड्स है कि एक ही जांच के साथ incubated हैं "सैंडविच" तैयार है. इस विधि के बारे में अधिक जानकारी के लिए, रेफरी देखें. 14. एक पूरी तरह से फ्लैट प्लास्टिक बॉक्स में आर्द्रता चैम्बर तैयार. वाटमान कागज के साथ बॉक्स के नीचे कवर milliQ पानी के साथ सिक्त, parafilm छोड़ने के कोनों खुला कागज के साथ कवर, प्लास्टिक बॉक्स में स्लाइड्स जगह और बॉक्स कसकर सील. वांछित संकरण तापमान आमतौर पर 50 में स्लाइड्स सेते हैं – 55 डिग्री सेल्सियस, चया 16-20 घंटे. के लिए अगली सुबह का उपयोग करने के लिए, 1 लीटर 0.2x एसएससी तैयार है और 55 डिग्री सेल्सियस पर इस दुकान इसके अलावा, 1 लीटर NTE बफर तैयार (0.5 एम NaCl, 10 Tris – एचसीएल मिमी pH7.5, 1 मिमी pH8.0 EDTA) और स्टोर 37 डिग्री सेल्सियस पोस्ट संकरण उपचार वर्गों को नुकसान नहीं coverslips ध्यान से निकालें. एक रैक में स्लाइड्स प्लेस और उन्हें दो बार में एक घंटे के लिए 0.2x एसएससी धो 55 ° सी में. नोट: Coverslips अक्सर बंद आसानी से गिर जब स्लाइड्स को सीधा रखा जाता है. यदि coverslip संलग्न रहता है, 1 या 2 मिनट के लिए गर्म 0.2x एसएससी में स्लाइड विसर्जित coverslip धो बंद. स्लाइड के coverslip खींच से बचें, के रूप में इस वर्गों के लिए नुकसान का कारण बन सकता है. इस बीच में, 500 मिलीलीटर धोने (1% BSA, टीबीएस बफर में 0.3% नरमीन) बफर और 100 मिलीलीटर अवरुद्ध समाधान (0.5% टीबीएस बफर में अभिकर्मक अवरुद्ध) तैयार करते हैं. टीबीएस में अवरुद्ध है कि धीरे धीरे 70 से गरम किया जाता है पाउडर हिलाओ डिग्री सेल्सियस और dissolv एक बार उसे कमरे के तापमान को शांतएड. नोट: बफर धोने और अवरुद्ध जरूरत समाधान फ्लैट 4.3.8 कदम -11 में प्रयुक्त प्लास्टिक बॉक्स के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे की मात्रा. यह कुछ समय लेने के लिए पूरी तरह से ट्राइटन भंग करेगा, तो अग्रिम में पर्याप्त समाधान तैयार. 2 मिनट के लिए 1x NTE में स्लाइड्स समभार बनाना. RNase 1x NTE बफर जो 20μg/ml RNase एक जोडी बस से पहले का उपयोग, 37 में सेते ° C 30 मिनट के लिए है. में स्लाइड स्थानांतरित द्वारा एक इलाज आगे बढ़ें नोट: RNase cleaves शाही सेना duplexes में बेमेल पर मुक्त एकल असहाय शाही सेना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से. इस कदम में मदद करता है गैर विशिष्ट जांच के बंधन के स्तर को कम करने के लिए, के रूप में cleaved जांच टुकड़े से पिछले 0.2x एसएससी धोने (4.3.6 देखें) में धो रहे हैं. 2 मिनट प्रत्येक के लिए 1x NTE में स्लाइड्स दो बार कुल्ला. एक घंटे के लिए 55 ° सी में ताजा 0.2x एसएससी में स्लाइड्स धो लें. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड्स समभार बनाना. रैक से वें पर स्लाइड्स का स्थानांतरणई एक फ्लैट प्लास्टिक बॉक्स के नीचे और उन्हें अवरुद्ध समाधान की एक न्यूनतम मात्रा के साथ कवर. एक धीरे से मिलाते हुए मंच पर 45 मिनट के लिए स्लाइड ब्लॉक. एक दूसरे स्वच्छ फ्लैट प्लास्टिक बॉक्स स्लाइड्स स्थानांतरण और उन्हें मिलाते हुए मंच पर बफर धोने के साथ 45 मिनट के लिए धो. एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए आगे बढ़ें. विरोधी digoxigenin में एंटीबॉडी (01:05 v / v) बफर धोने पतला और या तो एक न्यूनतम मात्रा सीधे या प्रत्येक स्लाइड पर लागू एक फ्लैट प्लास्टिक के बॉक्स में स्लाइड जगह और उन्हें एंटीबॉडी समाधान की एक न्यूनतम मात्रा के साथ कवर. कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे या रात भर के लिए 4 पर अंधेरे में स्लाइड्स सेते डिग्री सेल्सियस स्लाइड 15 मिनट प्रत्येक मिलाते हुए मंच पर बफर धोने के साथ के लिए 4 बार धोएं. बफर धोने और एक फ्लैट प्लास्टिक बॉक्स की एक न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें. Washes के प्रत्येक के बीच प्लास्टिक बॉक्स साफ़ करें. नोट: washes के बीच बॉक्स सफाई स्लाइड पर सामान्य पृष्ठभूमि कम होगा. यह को आसान बनाने में के लिए, हम दो समान फ्लैट बक्से का उपयोग करेंऔर एक साफ बॉक्स में प्रत्येक धोने के बाद स्लाइड्स हस्तांतरण. 1x टीबीएस में 2 मिनट के लिए स्लाइड्स का स्थानांतरण. तमिलनाडु बफर में स्लाइड्स को दो बार समभार बनाना 2 मिनट प्रत्येक के लिए. Μl 20 / 1 मिलीलीटर तमिलनाडु बफर प्रति एनबीटी BCIP जोड़कर उपयोग करने से पहले तुरंत धुंधला समाधान तैयार है. एक छोटे से प्लास्टिक पकवान वजन में धुंधला समाधान डालो. सैंडविच दो वर्गों के साथ एक दूसरे का सामना एक साथ स्लाइड. समाधान में सैंडविच की लंबी ओर डुबकी, केशिका कार्रवाई समाधान खींचने के लिए अनुमति देता है. Kimwipe पर स्लाइड्स नाली और एंटीबॉडी समाधान के साथ स्लाइड्स को फिर से भरने. आप स्लाइड्स नल के रूप में समाधान में बुलबुले से बचने के प्रवाह की आवश्यकता हो सकती है. एक प्लास्टिक और अंधेरे में कमरे के तापमान पर बॉक्स की दुकान में स्लाइड्स रखें. 15 दिन 10 दिन: ताज़ा दो बार तमिलनाडु बफर में स्लाइड्स rinsing और नए ताजा धुंधला समाधान युक्त सैंडविच तैयारी में 1-5 दिनों के लिए दैनिक धुंधला समाधान. नोट: नियमित int पर धुंधला समाधान की जगहervals पृष्ठभूमि अनुपात को संकेत में सुधार होगा. संकेत के विकास के एक परिसर या स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी की जा सकती है. यह संभव है वर्गों तस्वीर जबकि वे तमिलनाडु बफर में धुंधला के दौर के बीच में हैं या एक बार वे पानी में स्थायी बढ़ते से पहले बस स्थानांतरित कर रहे हैं. बढ़ते एक बार संकेत स्पष्ट है, milliQ एच 2 हे में स्लाइड्स कुल्ला और उन्हें जल्दी से एक श्रृंखला के माध्यम से इथेनॉल निर्जलीकरण: 10% इथेनॉल – 10 एस 30% इथेनॉल – 10 एस 50% इथेनॉल – 10 एस 70% इथेनॉल – 5 एस 80% इथेनॉल – 5 एस 95% इथेनॉल – 5 एस 100% इथेनॉल – 5 एस histoclear – 2 मिनट histoclear – 2 मिनट नोट: इन ऊष्मायन कम समय के प्रत्येक रखने के लिए सुनिश्चित करें, के रूप में संकेत घुलनशील इथेनॉल है. टोल्यूनि आधारित बढ़ते माध्यम से प्रत्येक पर एक या दो बूँदें रखकर स्लाइड्स माउंट गिरावटई और धीरे धीरे बुलबुले के गठन से बचने स्लाइड पर coverslip कम. बढ़ते मध्यम कठोर एक यौगिक खुर्दबीन के नीचे परिणाम का विश्लेषण करने से पहले रात में चलो. एक बार घुड़सवार, स्लाइड साल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम: 1-5 दिनों के बाद, एक लाल, बैंगनी संकेत जहां जांच पूरक टेप (चित्रा 1) संकरित है उन कोशिकाओं में विकसित होगा. रंग संकेत इस तरह हित के जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के सेलुलर संकल्प में एक प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है. एक कमजोर पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना भी विकास, गैर विशिष्ट जांच या संयंत्र के ऊतकों के धुंधला हो जाना (चित्रा 3) के बंधन से उत्पन्न हो सकता है. इस तरह की पृष्ठभूमि संकेत ऊतक के छोटे, कम निर्धारित कक्षों में अपेक्षाकृत अधिक स्पष्ट हो, लेकिन हो सकता है पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना भी नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण जांच करने के लिए संकरित वर्गों में मनाया जाएगा और नहीं होताप्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो. चित्रा 1. प्रतिनिधि परिणाम Arabidopsis और मक्का ऊतकों पर विभिन्न जांच के साथ अलग जीन विशिष्ट परिणाम है कि उल्लिखित प्रोटोकॉल के सफल समापन पर उम्मीद की जा सकती है के प्रकार illustrating जांच के साथ Arabidopsis के स्वस्थानी hybridizations (ई.) और मक्का ऊतकों (एह) में प्राप्त. (ए) का स्थानीयकरण Arabidopsis वनस्पति गोली मार सुप्रीम में (एसटीएम) SHOOTMERISTEMLESS1; meristem और आसपास के पत्तों में संकेत की कमी के अनिश्चित कोशिकाओं में बैंगनी नीले संकेत की उपस्थिति ध्यान दें. Arabidopsis टारपीडो चरण कुछ भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में CLAVATA3 (बी) अभिव्यक्ति दिखा भ्रूण की धारा (बी), AtML1 epidermal परत में अभिव्यक्ति, (सी) और वर्गों में संकेत के अभाव के साथ एक यादृच्छिक नकारात्मक नियंत्रण शाही सेना (D जांच). (ई) मक्का भ्रूण के विकास में एसटीएम homolog knotted1 का स्थानीयकरण, भ्रूण meristem और जड़ में विशेष रूप से मजबूत संकेत ध्यान दें. मक्का से वनस्पति गोली मार सुप्रीम arf3a (एफ) और ocl4 (जी) के लिए स्वस्थानी संकरण पैटर्न में अलग दिखा रहा है और नकारात्मक नियंत्रण (एच) जांच के लिए कोई संकरण संकेत के माध्यम से (एफ एच) अनुदैर्ध्य वर्गों. arf3a abaxial / नीचे पत्ती की सतह पर व्यक्त की है, जबकि AtML1 homolog ocl4 epidermis में विशेष रूप से व्यक्त किया है. निम्नलिखित जीन टुकड़े जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया: एसटीएम: सीडीएनए क्षेत्र शामिल एमिनो 81 एसिड – 382, जो संरक्षित homeodomain शामिल; CLV3: पूर्ण सीडीएनए लंबाई; AtML1: तीसरे एक्सॉन, kn1: पूरे खुला पढ़ने फ्रेम; arf3a: 9 nucleotides – सीडीएनए HM004539 क्लोन के 225; ocl4: 3 'पूर्ण सीडीएनए लंबाई, जो कई संरक्षित प्रोटीन डोमेन शामिल की 1.7 केबी. <p cलड़की = "jove_content"> चित्रा 2. अंक जाँच हो रही है, जबकि इन विट्रो प्रतिलेखन जांच में बना . (ए) एक मानक agarose जेल पर जांच में स्वस्थानी संकरण के बाद इन विट्रो प्रतिलेखन में जाँच कर रहे हैं (एक), DNase उपचार और इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (ख) के बाद शुद्धि के बाद hydrolysis अगर कार्बोनेट के बाद, आवश्यक ( ग) और जब (घ) का उपयोग करने के लिए तैयार है. ऐसी जांच के रूप में 1 में लंबाई में 250, बीपी पर जांच के लिए, कार्बोनेट hydrolysis छोटे जांच टुकड़े (कोष्ठक) की एक सीमा निकलेगा. (बी) डॉट धब्बा विश्लेषण द्वारा जांच की वर्णमिति मात्रा का ठहराव. Dilutions -1 10 से 10 एक 100 एनजी / μl नियंत्रण जांच (1) -5 और तीन डीआईजी लेबल जांच (2-4) नव लेकर एक हस्तांतरण झिल्ली, विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी के साथ incubated पर देखा जाता है, और assayed वर्णमिति प्रोटोकॉल 2.3 अनुभाग में उल्लिखित परख का उपयोग. विश्लेषण से पता चलता हैनिम्नलिखित अनुमानित सांद्रता: जांच, 2 ~ 100 एनजी / μl, 3 जांच, ~ 10 एनजी / μl 4 जांच ~ 1 एनजी / μl. जांच 4 स्वस्थानी संकरण संकेत में एक अच्छी उपज की संभावना नहीं है. चित्रा 3. एक गैर विशिष्ट जांच की एक अच्छी तरह से काम कर रहे जांच करने के लिए तुलना करें. मक्का से वनस्पति गोली मार सुप्रीम एक पृष्ठभूमि गैर विशिष्ट संकेत (ए) और बाहरी सेल परत (बी) में OCL5 जांच के लिए स्वस्थानी संकरण संकेत में एक विशिष्ट दिखाने के माध्यम से अनुदैर्ध्य वर्गों . चित्रा 4. स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में में कदम के समय रेखा दिखा आरेख. ऊतक एम्बेडिंग कदम, हरे, नारंगी में जांच तैयारी चरणों में संकेत कर रहे हैं, और नीले रंग में स्वस्थानी संकरण चरणों में . इस समयरेखा मानता है कि डीएनए templaते इन विट्रो प्रतिलेखन में जांच के लिए उपलब्ध है. Parafin एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक और डीआईजी लेबल जांच पहले से तैयार किया जा सकता है और संग्रहीत डिग्री सेल्सियस और -80 डिग्री सेल्सियस क्रमशः 4 में उपयोग के समय तक. स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में तब के रूप में छोटा रूप में चार दिनों में पूरा किया जा सकता है .

Discussion

स्वस्थानी संकरण विधि यहाँ उल्लिखित में महान सेलुलर संकल्प, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ spatiotemporal ब्याज की किसी भी जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है . जीन के बीच एक अभिव्यक्ति के स्तर के मात्रात्मक तुलना प्रोटोकॉल की अनुमति नहीं है. हालांकि, विधि उच्च संवेदनशीलता और संकल्प एक ^{8 ऊतक, 18,} ​​जो जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण का सबसे अन्य विधियों के साथ संभव नहीं है के भीतर जीन अभिव्यक्ति की ढ़ाल प्रकट कर सकते हैं.

प्रोटोकॉल के कई कदम है, जो मुसीबत शूटिंग समस्याग्रस्त कर सकते हैं शामिल हैं. प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम ऊतक के निर्धारण और चयन और जांच की लेबलिंग हैं. खराब घुसपैठ कम डीआईजी शामिल करने के साथ ऊतकों और जांच बहुत कमजोर संकेत है कि पृष्ठभूमि से ऊपर का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है उपज जाएगा. ब्याज की प्रत्येक नए जीन के लिए, यह सलाह दी जाती है के लिए कुछ अलग diffe से व्युत्पन्न जांच की कोशिशप्रतिलेख के क्षेत्रों का किराया. कभी कभी, दो या तीन जांच जीन के विभिन्न छोटे क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक मजबूत और विशिष्ट संकरण संकेत प्राप्त करने के लिए संयुक्त किया जा आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, संकरण की स्थिति, जैसे तापमान और संकरण बफर की संरचना, प्रत्येक जीन या ऊतक करने के लिए कम या संकरण तंगी में वृद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा protease उपचार कदम एक चर है और विभिन्न प्रजातियों के पौधे के लिए या बहुत कम बहुतायत के साथ टेप का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए बदला जा सकता है है. सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रण जांच के शामिल किए जाने के प्रोटोकॉल के समस्याग्रस्त बिंदुओं की पहचान करने में उपयोगी हो जाएगा.

प्रक्रिया आयल एम्बेडेड प्लान्ट टिशू वर्गों के लिए अनुकूलित है, लेकिन साथ मामूली संशोधनों पूरे माउंट के लिए भी कर सकते हैं स्वस्थानी संकरण में प्रयोग किया जाता है. हालांकि व्यापक रूप से स्वस्थानी संकरण ^में पशु 19 अनुसंधान, पूरे माउंट में इस्तेमाल मैं हो जाएगासंयंत्र है कि आसानी से घुसपैठ किया जा सकता है भ्रूण, जड़ों या युवा meristematic ^{ऊतकों} 20,21 जैसे ऊतकों, imited . प्रोटोकॉल भी आसानी से एक साथ दो अलग mRNAs का पता ^{लगाने} या 15,22,23 प्रोटीन के साथ – साथ टेप स्थानीयकरण संशोधित किया जा सकता है. अंत में, यह संभव है पौधों में छोटे आरएनए अभिव्यक्ति पैटर्न के दृश्य के लिए इस विधि का आवेदन का विस्तार. miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न दोनों मक्का और ^8,14 Arabidopsis में इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. हाल ही में, इन विट्रो लिखित जांच में द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआईजी लेबल बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) oligo जांच कि वृद्धि संकेत संवेदनशीलता ^{18, 24.}

Materials

Product	Company	Catalogue number	Remarks
Cytoseal 60 4oz	Fisher	23-244-256	Toluene-based 8310-4
Histoclear	Fisher	50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus	Fisher	23-021-400
N+ nylon membrane Hybond-N+	GE Healthcare	RPN203B
RNase OUT; 40 U/μL	Invitrogen	10777019
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl	Promega	M6101
DIG-labeled Control RNA	Roche	11585746910
DIG RNA labeling mix	Roche	11277073910
SP6 RNA polymerase 1,000 U	Roche	10810274001
T3 RNA polymerase 1,000 U	Roche	11031163001
T7 RNA polymerase 1,000 U	Roche	10881767001
RNase-A	Roche	109142	dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0
Blocking Reagent	Roche	1 096 176	Heat up to 70°C in TBS buffer
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U	Roche	1 093 274
NBT/BCIP stock solution	Roche	1 681 451
mini Quick Spin RNA Columns	Roche	11814427001
tRNA from E. coli	Roche	109541
Triton®X-100	Sigma	T8787
Tween-20	Sigma	P9416
Deionized formamide	Sigma	F9037
Protease from Streptomyces griseus Type XIV	Sigma	P5147	Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C
Triethanolamine	Sigma	90279	Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl
Acetic anhydride	Sigma	A6404
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma	D8906-5G	Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve.
Denhardt’s Solution 50x Concentrate	Sigma	D2532
Albumin from bovine serum – ≥98%	Sigma	A7906
Eosin Y disodium salt	Sigma	E4382	Dissolve in 96-100% ethanol until saturated
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Ethanol absolute 200 proof
Phenol/chloroform
Base moulds	Electronic Microsocpy Science	62352-15
Embedding rings	Fisher	22-038-197
20ml disposable scintillation vials, with caps	VWR	66020-326
Probe-on-plus slides	Fisher	22-230-900
Micro cover glasses 24×50 mm	VWR	48404-452
Whatman paper 3mm	VWR	89022-360
Three glass dishes and one stainless steel slide rack	Electronic Microsocpy Science	71420-25	Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment
18 clean plastic containers	Electronic Microsocpy Science	71402
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids			required for the hybridization and antibody steps
Fine brushes			Help handing wax ribbons
Microtome			Leica
Self-cleaning dry vacuum system	Welch	2025
Slide warmer	Fisher
Heating block			needed at 60°C and 85°C
Incubator at 58-60°C	Fisher		For steps with molten Paraplast
Ovens or water baths for 55°C and 37°C	Fisher		Need two due to the quick change between temperatures
Centrifuge (4°C – 20°C)
Fume hood