Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Summary

We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van mycobacteriën<em> In vitro</em>, Die reporter-gen maakt gebruik van gelabeld mycobacteriën in plaats van kolonievormende eenheden (CFU). "Overleven" van organismen als gastheer response-markers worden gelijktijdig gemeten, het verstrekken van een low-cost, veelzijdig en functioneel systeem voor de studie van gastheer / pathogeen interacties in de context van tuberculose.

Abstract

Functionele testen al lang een belangrijke rol gespeeld bij het meten van de immunogeniciteit van een bepaald vaccin. Dit wordt conventioneel uitgedrukt als serum bactericide titers. Studies van serum bactericide titers in reactie van vaccins voor kinderziekten hebben ons in staat te ontwikkelen en cut-off te valideren niveaus voor beschermende immuunrespons en dergelijke cut-offs zijn in routine gebruik. Dergelijke testen zijn naar voren opgenomen in de routine evaluatie van de vaccins die in de eerste plaats cel-gemedieerde immuniteit in de vorm van effector T-cel responsen, zoals tuberculose vaccins induceren. In het diermodel, is de prestatie van een bepaalde kandidaat-vaccin regelmatig geëvalueerd in gestandaardiseerde bactericide testen, en alle huidige nieuwe TB-vaccin kandidaten zijn onderworpen aan deze stap in de evaluatie voorafgaand aan een menselijke proeven fase. De beoordeling van de immunogeniciteit en daarom de waarschijnlijkheid van beschermende werkzaamheid van nieuwe anti-TB-vaccins moet een soortgelijke stapsgewijze evaluatie idealiter nu ondergaan in de menselijke modellen, inclusief metingen in bactericide assays.

Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn al goed ingeburgerd in de diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit. Er zijn echter geen dergelijke tests zijn verwerkt in klinische studies voor nieuwe anti-TB vaccins tot nu toe.

Hoewel er nog steeds onzekerheid over de precieze mechanismen die leiden tot het doden van mycobacteriën in de menselijke macrofagen, is de interactie van macrofagen en T-cellen met mycobacteriën duidelijk nodig. De test beschreven in dit document vertegenwoordigt een nieuwe generatie van bactericide testen die studies van dergelijke belangrijke cellulaire componenten mogelijk maakt met alle andere cellulaire en humorale factoren aanwezig zijn in bloed, zonder het maken van veronderstellingen over de relatieve individuele bijdrage. De assay beschreven door onze groep maakt gebruik van kleine hoeveelheden van bloed en is al toegepast in studies met volwassenen en kinderen in TB-endemische instellingen. We hebben laten zien immunogeniciteit van het BCG-vaccin, de toegenomen groei van mycobacteriën bij HIV-positieve patiënten, evenals het effect van anti-retrovirale therapie en vitamine D op mycobacteriële overleving in vitro. Hier vatten we de methodologie, en presenteren onze reproduceerbaarheid gegevens met behulp van dit relatief eenvoudige, goedkope en veld-vriendelijke model.

Let op: Definities / Afkortingen

BCG lux = M. bovis BCG, Montreal stam, getransformeerd met plasmide shuttle pSMT1 het dragen van de luxAB genen van Vibrio harveyi, onder de controle van de mycobacteriële GroEL (HSP60) promotor.
CFU = Colony Forming Unit (een maat voor mycobacteriële levensvatbaarheid).

Protocol

1. Voorbereiding van de BCG lux reporter mycobacteriën voorraad Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam getransformeerd met het plasmide pSMT1 shuttle) met schudden bij max. 200 omw tot medio logaritmische fase in Middlebrook 7H9 bouillon met 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 en 10% ADC verrijking. Bereid 1 ml van een 1:10 verdunning van BCG lux cultuur in steriele PBS in een luminometer buis (900μl PBS + 100μl BCG lux cultuur) in tweevoud. Laad buis met…

Discussion

Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn goed ingeburgerd in diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit.

De eerste generatie van de menselijke bactericide assays werden ontworpen met behulp van macrofagen alleen, die besmet zijn met M. tuberculose. CFU diende als de belangrijkste uitlez…

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures