Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)
Summary
Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des mycobactéries<em> In vitro</em>, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d'unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l'hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l'hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.
Abstract
Tests fonctionnels ont longtemps joué un rôle clé dans la mesure de l'immunogénicité d'un vaccin donné. Ceci est classiquement exprimée que le sérum des titres bactéricides. Etudes de sérum titres bactéricides en réponse aux vaccins infantiles ont permis de développer et valider de coupure niveaux pour des réponses immunitaires protectrices et de tels seuils sont utilisés en routine. Pas de tels dosages ont été prises vers l'avant dans l'évaluation de routine des vaccins qui induisent surtout immunité à médiation cellulaire sous la forme de réponses des lymphocytes T effecteurs, tels que les vaccins contre la tuberculose. Dans le modèle animal, la performance d'un candidat vaccin donné est systématiquement évaluée dans des essais standardisés bactéricides, et tous les courants roman TB-vaccins candidats ont été soumis à cette étape dans leur évaluation préalable à la phase 1 des essais humains. L'évaluation de l'immunogénicité et donc la probabilité de l'efficacité protectrice du roman de vaccins anti-tuberculeux devraient idéalement subir une similaires par étapes d'évaluation dans les modèles humains aujourd'hui, y compris des mesures dans les essais bactéricides.
Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont déjà bien établies dans les modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité. Cependant, aucune de tels dosages ont été incorporées dans les essais cliniques pour de nouveaux vaccins anti-tuberculeux à ce jour.
Bien qu'il reste encore une incertitude sur les mécanismes exacts qui conduisent à la mort de mycobactéries dans les macrophages humains, l'interaction des macrophages et des cellules T avec des mycobactéries est clairement nécessaire. L'essai décrit dans ce document représente une nouvelle génération de dosages bactéricides qui permet des études sur ces principaux composants cellulaires avec tous les autres facteurs cellulaires et humorales présents dans le sang total, sans faire des hypothèses sur leur contribution individuelle relative. Le dosage décrit par notre groupe utilise de faibles volumes de sang total et a déjà été employée dans les études sur les adultes et les enfants dans les paramètres de la tuberculose est endémique. Nous avons montré l'immunogénicité du vaccin BCG, l'augmentation de la croissance des mycobactéries dans les patients séropositifs, ainsi que l'effet de la thérapie anti-rétrovirale et la vitamine D sur la survie des mycobactéries in vitro. Nous résumons ici la méthodologie, et de présenter nos données de reproductibilité en utilisant ce modèle relativement simple, peu coûteuse et conviviale sur le terrain.
Remarque: Définitions / Abréviations
BCG lux = M. bovis BCG, la souche de Montréal, transformé avec pSMT1 plasmide navette transportant les gènes luxAB de Vibrio harveyi, sous le contrôle de l'origine mycobactérienne GroEL (hsp60) promoteur.
Unité UFC = Colony Forming (une mesure de la viabilité à mycobactéries).
Protocol
Discussion
Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont bien implantés dans des modèles animaux, où ils sont appliqués à l'écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l'immunogénicité.
La première génération de tests bactéricides humains ont été conçus en utilisant les macrophages seul, infectés par M. tubercu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des bourses personnelles par le Wellcome Trust à Beate Kampmann (056608, GRO77273).
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
Referências
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 .
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
